目的:阿特瑞斯酶是潜在的抗凝溶栓候选新药分子,前期建立了阿特瑞斯酶三步法的制备工艺。为建立可放大的分离制备工艺,本研究开展了对阿特瑞斯酶两步法制备工艺的优化,并从安全性的角度开展了阿特瑞斯酶对人微血管内皮细胞的影响研究。方法:将眼镜蛇毒粗毒采用不同两步纯化方法的组合(阳离子层析和肝素亲和层析、阳离子层析和分子筛层析、肝素亲和层析和阳离子亲和层析、肝素亲和层析和阳离子层析),通过改变缓冲体系、流速、洗脱盐浓度、梯度等条件对两步法阿特瑞斯酶的分离制备进行优化,并对前期建立的阿特瑞斯酶两步法的制备工艺进行放大研究。采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳对分离得到的样品进行电泳鉴定,凝血四项以及血栓弹力图对其活性进行研究。此外运用细胞培养实验,将微血管内皮细胞暴露于不同浓度的阿特瑞斯酶,采用MTT法、形态学观察分别检测阿特瑞斯酶对人微血管内皮细胞生长的影响;流式细胞仪检测阿特瑞斯酶对人微血管内皮细胞ROS、Ca~(2+)内流水平、线粒体膜电位、凋亡、周期的影响以及人微血管内皮细胞表面ICAM-1的表达情况;化学发光法检测ATP含量的变化;ELISA检测细胞培养上清中炎症介质的含量变化;RT-q PCR检测细胞中炎症介质和黏附分子m RNA的表达水平;Western blot检测凋亡以及NF-кB和MAPK信号通路相关蛋白的表达水平;通过EDTA与阿特瑞斯酶孵育后制备失活的阿特瑞斯酶,观察其对内皮细胞的影响的变化情况。结果:通过不同两步纯化方法的组合,获得的阿特瑞斯酶均存在少量杂蛋白,其中眼镜蛇毒粗毒经过Heparin Sepharose 6 Fast Flow肝素亲和层析,再经过Superdex75 prep grade分子筛层析获得的阿特瑞斯酶,纯度最高为85.22%。对于前期采用SP Sephadex C-25阳离子层析及Hitrap Heparin HP肝素亲和层析两步法获得的阿特瑞斯酶的的制备工艺进行了进一步的研究,初步证实了此PLX4032使用方法工艺的可放大性。对两步法放大制备的阿特瑞斯酶的活性测定结果表明,阿特瑞斯酶有显著的抗凝活性。体外细胞实验中,MTT检测结果显示0.003 mg/m L的阿特瑞斯酶对内皮细胞的活力基本上没有影响,而0.03 mg/m L和0.3 mg/m L的阿特瑞斯酶可明显抑制内皮细胞的生长。selleck化学镜检结果显示,阿特瑞斯酶可使内皮细胞的形态发生明显变化。并且通过流式细胞仪检测到阿特瑞斯酶可影响内皮细胞的周期,6 h时G1期细胞百分比明显减少,12 h时G2期细胞百分比明显增加。阿特瑞斯酶作用于内皮细胞后,检测到12 h后ROS水平升高,3、6、12、24 h后Ca~(2+)水平均有不同程度的升高,在24 h时,线粒体膜电位及ATP含量降低,ICAM-1、IL-6、IL-8和MCP-1表达上调,NF-кB p65和ERK磷酸化水平明显上调,48 h时检测到阿特瑞斯酶可诱导人微血管内皮细胞发生凋亡,并且凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2的比值以及caspase3出现上调。而失活的阿特瑞斯酶作用于内皮细胞后,内皮Genetic-algorithm (GA)细胞的形态没有发生明显变化,细胞内ROS水平没有上调,同时细胞没有发生凋亡。结论:1.眼镜蛇毒粗毒经过Heparin Sepharose 6 Fast Flow肝素亲和层析,再经过Superdex 75 prep grade分子筛层析获得的阿特瑞斯酶的纯化方法最合理,纯度最高,为85.22%。2.初步证实了SP Sephadex C-25阳离子层析及Hitrap Heparin HP肝素亲和层析两步法的可放大性。3.阿特瑞斯酶在体外可诱导人微血管内皮细胞活化、产生炎症反应和凋亡,其机制与金属蛋白酶结构域有关。