铁线莲(Clematis florida Thunb.)是毛茛科铁线莲属的一种藤本植物,植株高度约1～2 m,其品种多样、花型花色丰富,是景观篱墙的良好材料。但因其株型过高,不适宜作为盆栽花卉进行居家观赏。基因工程改良植物性状已成为行业热点,利用基因工程技术培育铁线莲矮化品种具有重要的意义。许多研究表明,SHI家族成员参与了植物侧根的形成和发育、茎的延伸、叶片的形态发生和根瘤的发育,还参与调控雌蕊和雄蕊的发育和开花时间,尤其在株高方面,SHI基因的过量表达会引起植物的矮化。铁线莲SHI相关基因功能的研究还未见报道。本试验筛选出适宜铁线莲不同组织部位的qRT-PCR内参基因;通过铁线莲‘紫水晶美人’盛花期的转录组数据,鉴定出铁线莲SHI转录因子家族成员,并对其进行了生物信息学和表达定量分析、亚细胞定位研究;优化了铁线莲抗性愈伤组织的分化,完善了农杆菌介导的铁线莲遗传转化体系,使用pSAK277-At SHI表达载体进行铁线莲遗传转化,获得转基因植株;构建pSAK277-CfSHI表达载体,稳定转化铁线莲和拟南芥验证其功能。研究结果为铁线莲分子育种和矮化品种培育奠定基础。主要研究结果如下:1.铁线莲不同组织部位qRT-PCR内参基因的筛选:通过铁线莲‘紫水晶美人’转录组数据,初步筛选出15个内参基因,使用qRT-PCR技术对15个内参基因在铁线莲‘紫水晶美人’不同组织部位进行定量分析,使用比较Delta-Ct法,ge Norm、Normfinder、Bestkeeper软件分析不同组织部位各内参的总体稳定性,使用在线软件Refinder综合分析,最终筛选出适合的2个内参基因为Atpb和PSMDA。通过铁线莲MYB 52基因的表达分析验证了内参基因的稳定性,且试验得出这两个基因也适合作为铁线莲‘王梦’不同组织部位的qRT-PCR内参。后续qRT-PCR内参可以选取Atpb、PSMDA、或Atpb+PSMDA。2.铁线莲SHI转录因子家族鉴定及生物信息学分析:利用生物信息学分析方法从铁线莲‘紫水晶美人’转录组数据中筛选出4个SHI家族成员,通过序列比对分析和系统进化树分析,分别命名为CfSRS5、Cf LRP1、CfSRS7、CfSHI。对SHI蛋白序列特征进行分析,发现它们的氨基酸序数目在109～329之间,理论等电点为5.72～9.71之间,分子量在11604.64～3Rapamycin试剂5069.90之间,该家族蛋白全部为亲水性蛋白;进化树分析得出CfSRS5、CfSRS7、CfSHI为一亚族,Cf LRP1为另一亚族。qRT-PCR结果表示,CfSHI基因在铁线莲‘紫水晶美人’和‘王梦’盛花期不同组织部位的表达趋势基本一致,在根系、叶片中获悉更多表达量较高,在铁线莲‘紫水晶美人’的根系中表达量约为其他部位的2倍。克隆了990bp的CfSHI基因cDNA序列,构建了CfSHI基因的表达载体pCAMBIA1302-CfSHI,亚细胞定位结果验证了CfSHI蛋白定位在细胞核,与在线预测结果一致。3.pSAK277-CfSHI基因表达载体的构建及转化拟南芥:构建了CfSHI基因的表达载体pSAK277-CfSHI。CfSHI基因在拟南芥中过表达,转基因拟南芥的株高显著矮于野生型拟南芥,叶面积也比较小,呈卷曲状,几乎观察不到叶柄。在开花时间上,大部分转基因植株比野生型晚20 d左右。显微观察种子成熟期拟南芥倒数第三节茎段的横纵切面,横切面采用维管层和皮层宽度的比值来表征节间发育的特点,结果显示转基因拟南芥维管层和皮层宽度的比值显著大于野生型拟南芥,表明转基因拟南芥维管组织发育需要的时间比野生型拟南芥短,导致转基因拟南芥节间的发育时间较短,从而使得其节间长度小于野生型而导致的矮化;转基因拟南芥的纵切面细胞宽度相比野生型拟南芥较小,细胞长度比野生型短很多,表明转基因植株节间短是由于细胞的体积减小造成的。4.铁线莲遗传转化体系的完善及SHI基因遗传转化:对铁线莲遗传转化体系进行完善,筛选出最适铁线莲抗性愈伤组织分化的培养基配方:MS+6-BA 3.00 mg/LPancreatic infection+2,4-D 0.10 mg/L+Kan 20mg/L+Carb300mg/L,抗性愈伤组织不定芽分化率为70.00%;At SHI基因在铁线莲中过表达,获得了转基因植株,转基因植株出现了明显的矮化效果,且叶片出现卷曲现象。CfSHI基因转化铁线莲,获得了转基因抗性愈伤组织。