全氟辛烷磺酸盐(perfluorooctane sulfonates,PFOS)是一种人造含氟表面活性剂,在生活中被普遍使用,但由于其具有难以降解性、远距离迁移能力、较强的生物蓄积性等,引起了研究者对其人类健康风险的日益关注。流行病学研究表明,PFOS所属的全氟化合物暴露可能会增加人类患心血管(cardiovascular disease,CVD)等疾病的风险。PFOS在母体及胎儿脐带血的样本中都有检出,可对血管内皮产生不利影响。内皮损伤是发生CVD的基础,但PFOS导致内皮损伤的机制不清。铁死亡是一种调节性的细胞死亡,由细胞代谢和铁依赖性脂质过氧化驱动,铁死亡在PFOS所致的内皮功能障碍的发病机制中的作用尚不清楚。本研究以人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)为研究对象,探讨铁死亡在PFOS致HUVECs的损伤作用。目的:探讨PFOS对氧化应激相关蛋白及其他指标表达的影响;通过检测铁死亡相关蛋白及其他指标的表达,明确PFOS对HUVECs中的铁死亡通路的影响;通过铁死亡抑制剂的干预,检测内皮损伤相关蛋白及其他指标的表达,阐明PFOS诱导HUVECs损伤中铁死亡通路的作用。方法:1.细胞培养及分组:HUVECs在含有10%胎牛血清的1640培养基中体外培养。当细胞密度约70%～80%时,正常对照组不作处理;溶剂对照组用0.1%DMSO 处理 12 h;PFOS 组用 180 μMPFOS 处理 12 h;PFOS+Fer-1 组预先给予1 μM Fer-1 抑制剂2 h,再用 180 μM PFOS 处理 12 h。2.CCK-8法检测不同时间及浓度染毒条件下HUVECs的细胞存活率,并确定PFOS的最适染毒浓度与染毒时间。3.采用DCFH-DA荧光探针染色法测定细胞ROS水平。4.流式细胞术检测细胞脂质活性氧(Lipid-ROS)水平。5.试剂盒检测Fe2+、MDA、GSH、GPX4、NO、PGI2 含量。6.透射电镜观察细胞微观结构改变。7.划痕试验检测细胞迁移(愈合)能力selleck激酶抑制剂。8.免疫荧光法检测细胞CD31水平。9.采用Western blot法,检测氧化应激相关蛋白(Nrf2、Keap1)、铁死亡相关蛋白(ACSL4、FTH1、GPX4、P53)、内皮损伤相关蛋白(eNOS、CD31、MCP-1、COX-2)的表达。10.采用IBM SPSS 24.0软件分析处理数据,计量资料的各组数据以x±s表示,正态且方差齐的数据,采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)比较不同组间各指标的差异,采用LSD法进行组间的两两比较。以P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.PFOS对HUVECs存活率的影响随着PFOS浓度及染毒时间的增加,细胞存活率显著降低。染毒时间为12h时,PFOS的IC50值为180 μM,将此时间及浓度作为后续实验的染毒条件。2.PFOS对HUVECs中ROS及Lipid-ROS水平的影响与正常对照组和DMSO组比较,PFOS组ROS水平显著升高(P<0.05);PFOS+Fer-1组产生ROS水平显著低于PFOS组(P<0.05);与正常对照组和DMSO组比较,PFOS组产生Lipid-ROS水平显著升高(P<0.05);与PFOS组相比,PFOS+Fer-1组产生Lipid-ROS水平显著降低(P<0.05)。3.PFOS对HUVECs中氧化应激相关蛋白表达水平的影响与正常对照组及DMSO组比较,PFOS组的Nrf2蛋白表达水平显著上升,Keap1蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。与PFOS组比较,PFOS+Fer-1组的Nrf2蛋白表达水平显著下降,Keap1蛋白表达水平显著上升(P<0.05)。4.PFOS 对 HUVECs 中 Fe2+、MDA、GSH、GPX4 含量的影响与正常对照组和DMSO组相比,PFOS可显著增加细胞中Fe2+、MDA的含量(P<0.05),显著降低GSH、GPX4含量(P<0.05)。而经Fer-1处理后,Fe2+、MDA的含量显著降低(P<0.05group B streptococcal infection),GSH、GPX4含量显著增高(P<0.05)。5.PFOS对电镜下HUVECs超微结构改变的影响与正常对照组相比,在PFOS组细胞中观察到大量脂滴,一些细胞具有更小且萎缩的线粒体,线粒体嵴减少,线粒体膜密度增加。而与PFOS组相STM2457试剂比较,PFOS+Fer-1组脂滴相对减少,线粒体体积更大且萎缩程度低。6.PFOS对HUVECs中铁死亡相关蛋白表达水平的影响与正常对照组和DMSO组相比,PFOS可显著增加细胞内ACSL4、P53的表达(P<0.05),显著降低GPX4及FTH1表达(P<0.05)。而经Fer-1处理后,ACSL4、P53的表达显著降低(P<0.05),FTH1、GPX4显著增高(P<0.05)。7.PFOS对HUVECs迁移(愈合)能力的影响划痕12 h及24 h后,PFOS组的愈合能力显著低于正常对照组及DMSO组(P<0.05);而PFOS+Fer-1组的愈合能力显著高于PFOS组(P<0.05),但同样显著低于正常对照组及DMSO组(P<0.05)。8.PFOS对HUVECs中内皮收缩指标NO、PGI2含量的影响与正常对照组及DMSO组相比,PFOS组中的NO含量显著下降,PGI2含量显著上升(P<0.05),而PFOS+Fer-1组中的NO含量与正常细胞组无统计学差异,PGI2的含量和PFOS组相比较,显著下降(P<0.05)。9.PFOS对HUVECs中内皮损伤相关指标表达水平的影响与正常对照组及DMSO组比较,PFOS组细胞的eNOS、MCP-1和COX-2蛋白表达水平显著升高(P<0.05),CD31荧光强度显著高于正常对照组及DMSO 组(P<0.05);与 PFOS 组比较,PFOS+Fer-1 组细胞的 eNOS、CD31、MCP-1和COX-2蛋白表达水平显著降低(P<0.05),CD31的荧光强度显著低于 PFOS 组(P<0.05)。结论:1.PFOS可通过激活Nrf2-Keap1通路引起HUVECs产生氧化应激;2.PFOS可通过激活脂质过氧化通路、抑制Xc-GSH-GPX4通路引起HUVECs发生铁死亡;3.PFOS可通过激活氧化应激通路及铁死亡通路诱导HUVECs发生损伤;4.铁死亡抑制剂可减轻PFOS所导致HUVECs的损伤程度,这为从铁死亡角度预防PFOS给内皮细胞带来的损伤提供了新的思路。