乳腺癌(breast cancer,BC)是一种高度异质性的乳腺上皮组织恶性肿瘤,位居全球女性新发肿瘤首位。乳腺癌的发生受遗传因素和环境因素共同影响,且因其病理分型多样,转移后患者生存率骤降的特性,临床治疗上依然面临诸多的挑战。因此,发掘BC的发生发展及影响其预后的新机制、继而寻找新的肿瘤标志物,对BC的临床治疗意义重大。跨膜蛋白 16F(Transmembrane Protein 16F,TMEM16F)又称 Anoctamin(ANO)6,是一种钙激活的氯离子通道,在许多细胞中广泛表达,具有细胞调节功能,该蛋白家族由10个成员组成,ANO6为其中第6个成员。ANO6具有通道蛋白及磷脂翻转酶双功能,参与铁死亡途径,在多种癌细胞中检测到表达,与癌细胞的增殖、迁移和侵袭密切相关。课题组首先利用了 TCGA数据库分析BC肿瘤组织及癌旁组织中hANO6表达差异,构建相应的预后模型,并使用GEO数据库进行验证,发现hANO6在BC中低表达且与BC不良预后相关。随后收集临床组织样本,通过qRT-PCR及IHC验证hANO6在BC肿瘤组织中的表达差异,并利用qRT-PCR检测了不同乳腺癌细胞株中hANO6的表达,进而构建过表达hANO6的细胞株研究其在体外对乳腺癌发展的影响,并对其背后的机制进行初探,结合预后分析为BC临床治疗提供新的思路。方法:1.运用生物信息学方法从TCGA数据库中分析hANO6在BC中的表达,构建预后模型,并利用GEO数据集验证分析结果及模型可靠性。2.收集BC患者新鲜肿瘤组织及癌旁组织,提取RNA,使用qRT-PCR检测hANO6的mRNA表达差异;制作石蜡组织切片,IHC验证hANO6蛋白表达差异;同时提取不同乳腺癌细胞株MDA-MB-231,MDA-MB-453,MDA-MB-468,MCF10A,MCF-7 中 RNA,使用 qRT-PCR 检测 hANO6 的 mRNA 表达差异。3.稳定过表达hANO6的乳腺癌细胞株构建。将慢病毒质粒pCDH-FH-hANO6与相应的包装质粒(VSVG、MDLG、REV)共转染293T细胞,制备过表达hANO6的慢病毒液。将该病毒液感染BC细胞株MDA-MB-231,经嘌呤霉素筛选,构建过表达hANO6的稳转细胞株。经qRT-PCR、IFA实验分析上述细胞株中hANO6在基因水平及蛋白水平的表达。成功构建的过表达细胞株分别命名为231-FH,231-hANO6。4.平此网站板克隆、MTT增殖实验分析hANO6过表达后对人乳腺癌细胞株增殖能力的影响;划痕实验分析hANO6过表后对人乳腺癌细胞株迁移能力的影响;transwell实验评价hANO6过表达后对人乳腺癌细胞株侵袭能力的影响。5.Western blot方法分析hANO6过表达细胞株231-hANO6中EMT相关蛋白 E-cadherin、N-cadherin、snail、Vimentin,以及铁死亡检测蛋白 GPX4,ERK的表达水平,探寻ANO6通过铁死亡途径影响乳腺癌进展和预后的机制。结果:1.通过对TCGA数据库中乳腺癌患者基因测序信息的分析,发现hANO6在BC组织中低表达,并与另外4个铁死亡相关基因ALOX15B、CHAC1、IFNG、TP63作为综合标志构建了预后模型。与低风险组患者相比,高风险组患者预后显著不良,且高风险组患者中hANO6相对高表达。随后分析GEO数据集GSE20685验证了 hANO6的表达情况及预后模型的准确性,结果一致且可靠。2.qRT-PCR和IHC结果表明,相较于癌旁组织,hANO6 mRNA在BC肿瘤组织中低表达。相较于乳腺对照细胞株MCF-1 0A,hANO6mRNA在乳腺癌细胞株MCF-7中表达无明显差异,在MDA-MB-231和MDA-MB-468中表达略高,在MDA-MB-453中表达明显升高。3.qRT-PCR和IFA实验结果显示,稳定过表达hANO6的乳腺癌细胞株231-hANO6构建成功。平板克隆、MTT实验结果表明,hANO6过表达后,对细胞株231-hANO6的增殖影响不显著,细胞划痕实验及transwell实验结果显示,过表达hANO6后,231-hANO6的迁移、侵袭能力均得到显著增强。提示在乳腺癌细胞株中,hANO6具有促进乳腺癌进展的作用。4.Western blot结果表明hANO6过表达细胞株231-hANO6中,EMT相关蛋白N-cadherin、snail表达上调,Vimentin、E-cadherin表达量没有明显变化,铁死亡检测蛋白GPX4表达上调,ERK表达Medical hydrology上调。Wnt-C59化学结构结论:hANO6在乳腺癌肿瘤组织中低表达,其中hANO6相对高表达的高风险评分组患者预后更差;过表达hANO6后BC细胞株的侵袭和迁移能力得到显著性提高,其EMT相关蛋白snail和N-cadherin表达水平得到上调。并且,hANO6通过上调ERK和GPX4的表达水平来抑制BC细胞的铁死亡通路,从而促进BC的进展和不良预后。