研究目的:本实验通过构建大鼠咬合高度下降致TMJ OA模型,探究炎性微环境下关节软骨及软骨下骨改变和破骨细胞来源,进一步研究Wnt(LRP5/6)信号通路在TNF-α诱导滑膜来源的破骨细胞分化时所产生的作用,并探索了其深层分子机理,从而揭示TMJ OA在体内发生、发展的机制,旨在为TMJ OA的治疗寻求新的治疗靶点。研究方法:1.为研究大鼠髁突软骨改变,我们建立大鼠后牙高度降低模型,然后在模型成功建立后的3个时间点,分别为2周、4周、8周收集大鼠髁突标本。2.采用Micro-CT观察和评估大鼠实验组和对照组间髁突改建、软骨及软骨下骨形态及骨组织学改变、苏木精/伊红(HE)染色观察大鼠颞下颌关节软骨及软骨下骨的变化;采用番红O-固绿染色(Safranin O-Fast Green)观察软骨基质变化,免疫组化(immunohistochemistry)PEG300体内实验剂量及免疫荧光(Immunofluorescence technique)检测COLX、PCNA等成软骨相关基因及RANK等细胞破骨分化相关基因表达水平变化,TUNEL染色检测软骨细胞凋亡情况。3.体外实验不同浓度TNF-α作用下对破骨前体细胞RAW264.7分化的筛选与研究。实验组分为RAW264.7+诱导剂(RANKL)组、RAW264.7+诱导剂(RANKL)+TNF-α(10ng/ml)组、RAW264.7+诱导剂(RANKL)+TNF-α(25ng/ml)组与单独培养的RAW264.7作对比,通过TRAP染色检测破骨分化,qRT-PCR检测RANK相关mRNA表达,Western-blot检测RANK蛋白表达。Annexin V-FITC/PI检测破骨前体细胞凋亡率,筛选出破骨分化最明显的实验组TNF-α浓度作为TNF-α最适浓度。4.为探究经典Wnt信号通路在TNF-α诱导破骨分化时产生的作用。在RAW264.7破骨分化过程中分别给予Wnt3a及Wnt5a抑制剂,与对照组对比,通过TRAP染色检测破骨分化,qRT-PCR检测RANK相关mRNA表达,Western-blot检测RANK蛋白表达。5.为研究Wnt/(LRP5/6)信号通路在TNF-α诱导破骨分化中的影响。在RAW264.7破骨分化过程中分别给予DDK-1及MDC。与空白对照组对比,通过TRAP染色检测破骨分化,qRT-PCR检测RANK相关mRNA表达,Western-blot检测RANK蛋白表达。研究结果:1.经HE染色检测,实验组的大鼠髁突发生退行性变,其中,软骨小梁顺序异常,软骨细胞的密度大幅降低,并伴有时间的增加,这种变化的程度也逐渐加剧,直至8周,髁突的结构破坏达到顶点。2.番红O-固绿染色显示:大鼠髁突软骨中软骨基质丢失随时间增加而增多,8周时达到顶点。3.Micro-CT显示:与对照组相比,实验Medicine history组髁突软骨下骨骨小梁厚度(Tb.Th),骨小梁数量(Tb.N),相对骨体积分数(BV/TV),骨密度(BMD)明显减少,随时间延长骨质破坏更多。4.免疫组化显示:与对照组相比,实验组软骨中COLX、TUNEL、TNF-α的阳性细胞数增加,滑膜中RANK阳性细胞数增加。而软骨中PCNA染色的阳性细胞则无明显变化。5.免疫荧光显示:与对照组相比,实验组软骨免疫荧光三染COLⅡ-PCNA-TNF-α中PCNA表达量无明显变化,而TNF-α表达明显上升。在免疫荧光三染COLⅡ-COLX-TNF-α中,软骨COLX及TNF-α在实验组中较对照组皆有明显上升。在免疫荧光三染RANK-Wnt3a-LRP5/6中,与对照组相比,实验组滑膜中的RANK表达量较对照组有较大提升,而Wnt3a与LRP5/6的表达量则相对降低。6.Annexin V-FITC/PI结果显示,RAW264.7+诱导剂(RANKL)+TNF-α(25ng/ml)组相较RAW264.7+诱导剂(RANKL)+TNF-α(10ng/ml)组及对照组细胞凋亡率明显增大。7.qRCanagliflozin说明书T-PCR及Western-blot结果显示:在RAW264.7+诱导剂(RANKL)+TNF-α(10ng/ml)组中,RANK相关mRNA及蛋白质表达明显高于RAW264.7+诱导剂(RANKL)+TNF-α(25ng/ml)组。Wnt5a抑制剂组RANK的mRNA及蛋白质表达明显低于Wnt3a抑制剂组。DDK1组RANK的mRNA及蛋白质表达明显高于对照组及MDC组。研究结论:在咬合高度下降致TMJ OA发生、发展过程中,肥大化的软骨细胞所分泌的TNF-α对关节滑膜中破骨前体细胞分化有着重要的调控作用。本研究证明TNF-α在调控破骨细胞分化过程中,Wnt/(LRP5/6)信号通路对破骨分化起抑制作用,即咬合高度降低通过抑制Wnt/(LRP5/6)信号通路的活化而促进TMJ OA发生、发展。揭示了应力刺激致TMJ OA的深层分子机制,为阐明其治疗的细胞及分子机理提供新思路,为临床TMJ OA治疗提供新的理论依据。