负载芦荟大黄素的ZIF-8/TF-PEG-PLGA纳米粒抗脑胶质瘤作用及机制研究

目的胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)是最常见、最致命的颅内恶性肿瘤,具有高发病率、高死亡率和低治愈率的特点。化疗药物是治疗肿瘤的重要方法,但其治疗胶质瘤面临血脑屏障、耐药、毒副反应的挑战,而免疫抑制的肿瘤微环境也是GBM治疗面临的难题之一。焦亡是新发现一种免疫原性的程序性细胞死亡方式,由于其直接的诱导细胞死亡的作用以及免疫调控作用,被认为在肿瘤的治疗中具有良好的前景。芦荟大黄素(aloe-emodin,AE)是一种从多种中药中提取的单体化合物,我们的研究发现AE可以以诱导胶质瘤细胞出现Caspase-3/GSDME途径的焦亡,而GBM中高表达的GSDME也使其成为诱导焦亡抗肿瘤的良好靶点,但AE的血脑屏障穿透能力、肿瘤靶向能力及脱靶副反应制约了其临床应用。在本研究中我们一方面研究AE诱导GBM焦亡的效应及机制,另一方面,为了提高其血脑屏障穿透能力及肿瘤靶向能力,我们构建了负载AE的覆盖Tf-PEG-PLGA涂层的ZIF-8纳米粒(AE loaded Tf-PEG-PLGA coated nanoparticle,AE@ZIF-8/Tf-PEG-PLGA NPs,AE-NPs),分析其血脑屏障穿透能力、肿瘤的靶向性、体内代谢分布和安全性,并探讨其如何调控GBM免疫微环境及其体内发挥抗肿瘤的作用机制,以期为GBM的治疗提供一种新的策略,为跨血脑屏障GBM靶向递药提供一种安全、高效、减毒的载体。方法1.芦荟大黄素体外抗GBM作用及机制研究:梯度浓度AE处理体外培养的GBM细胞,通过MTT实验检查GBM细胞活力;通过细胞形态学观察及LDH释放实验检测AE对GBM细胞的焦亡诱导作用;通过网络药理学分析AE作用GBM的关键靶点及焦亡通路相关靶点;通过TCGA数据库及WB明确GSDME在GBM组织及细胞系中的表达水平;通过免疫印迹实验(Western blot,WB)检测AE对焦亡关键蛋白Caspase-1、GSDME、caspase-3、GSDME蛋白的活化作用;通过免疫荧光(Immunofluorescence,IF)检测AE处理后的GBM细胞GSDME的表达;通过q PCR检测AE对GBM细胞GSDME在m RNA水平的调控作用;采用DCFH-DA标识GBM细胞活性氧;通过荧光显微镜及流式细胞术检测AE处理的GBM细胞活性氧产生水平;通过活性氧抑制剂检测ROS对AE介导焦亡的影响;通过JC-1试剂盒检测线粒体膜电位变化。2、负载AE的ZIF-8/Tf-PEG-PLGA纳米粒合成及性能研究:通过溶剂法在硝酸锌和2-甲基咪唑矿化的过程中合成AE@ZIF-8纳米粒;采用EDC/NHS两步偶联法将Tf连接在COOH-PEG-PLGA多聚物COOH端构建Tf-PEG-PLGA多聚物;利用ZIF-8纳米粒的吸附作用构建覆盖Tf-PEG-PLGA涂层的负载AE的ZIF-8纳米粒(AE-NPs);通过马尔文粒径电位分析仪检测纳米粒表面电荷及粒径;通过紫外分光光度计检测AE的载药率;通过BCA试剂盒检测Tf连接率;通过透射电镜及红外光谱鉴定AE-NPs是否构建成功;以吲哚菁绿(Indocyanine Green,ICG)为纳米示踪剂,构建ICG-NPs,通过流式细胞术分析及激光共聚焦显微镜评价NPs细胞摄入;通过CCK-8评价AE-NPs体外抗胶质瘤作用;通过高内涵细胞成像系统检测AE-NPs对GBM细胞焦亡发生的影响,通过透射电镜及体外累及释放评价p H敏感性;通过小动物活体成像系统评价纳米粒颅内及器官分布;制备冰冻切片,利用激光共聚焦显像检测药物的肿瘤靶向能力。3.AE-NPs体内抗胶质瘤作用及机制研究:采用C57BL/6J小鼠,利用GL261细胞构建颅内原位移植胶质瘤小鼠模型,分组处理(Con组、NPs组、AE组、AE@ZIF-8组、AE-NPs组),利用小动物活体成像检测各组肿瘤生长情况;每周检测动物体重,处理期结束麻醉后采血,取脑、瘤、心、肝、脾、肺、肾,分析各组瘤体大小和重量,统计生存率;HE染色评价GBM坏死情况;Ki-67染色评价肿瘤增殖水平;Westren blot检测Caspase-3、GSDME等焦亡关键指标评价肿瘤焦亡水平MRTX1133细胞培养;流式细胞术及免疫荧光检测M1型肿瘤相关巨噬细胞、CD8~+T、CD4~+T细胞、Treg细胞等免疫细胞的浸润评、q PCR检测抗肿瘤免疫相关细胞因子IFN-γ、TNF-α、HMGB1的表达。4、体内外安全性评估:使用CCK-8试剂盒检测硝酸锌、ZIF-8、Tf-PEG-PLGA、NPs、AE-NPs体外细胞毒性;采用ALT、AST、γ-GT、BUN、Cr检测试剂盒检测各处理组对荷瘤小鼠及健康小鼠肝肾功能的影响;通过脏器HE染色分析组织器官损伤。结果(1)第一部分AE通过激活Caspase-3/GSDME通路发挥抗胶质瘤作用:与对照组相比,AE呈剂量依赖型和浓度依赖型的抑制GBM细胞活性(P<0.05),诱导GBM细胞出现焦亡特异性外观和LDH释放;网络药理学显示焦亡关键蛋白Caspase-3是AE抗GBM核心靶点之一;Westren blot显示AE剪切活化焦亡关键蛋白Caspase-3、GSDME;q PCR和免疫荧光显示AE在m RNA和蛋白水平升高GSDME的表达;JC-1染色显示AE诱导GBM细胞线粒体膜电位降低;活性氧探针DCFH-DA显示AE诱导GBM细胞活性氧产生;WB实验显示活性氧抑制剂能部分阻断焦亡关键蛋白GSDME的活化;TCGA数据库显示相较于其他类型的肿瘤,GSDME在胶质瘤中高表达,这种水平的表达也高于正常脑组织;WB显示相较于其他肿瘤细胞系,GSDME在胶质瘤细胞系中有更高的表达。(2)第二部分AE-NPs的制备及性能检测:AE-NPs表征检测提示,所制备的AE-NPs纳米粒水动力尺寸为:199±85nm;透射电镜检测粒径为:46.52±6.43nm;表面zeta电位为:13.8±6.49n VFer-1体内实验剂量;载药率为:15.43%;转铁蛋白连接率为:4.24%;电镜下见ZIF-8表面附着的明显涂层;傅里叶红外光谱(FTIR)在1500–1700 cm~(-1)处发现了新的氨酰键特征性吸收峰;体外释放实验显示:AE-NPs在肿瘤酸性微环境(p H=5.5)下缓慢释放,在中性环境下保持稳定;细胞摄入检测显示:ICG-NPs组阳性细胞比例及荧光强度明显高于ICG组及ICG@ZIF-8组,至1.5h ICG阳性细胞数量能达到99.04%;激光共聚焦显微镜下显示:ICG-NPs组荧光强度明显强于ICG组;共聚焦高内涵成像分析系统显示NPS的包封能增强AE诱导焦亡的能力;体内分布显示与ICG及ICG@ZIF-8组相比,ICG-NPs在15分钟内迅速实现颅内富集,24小时后仍有明显的颅内滞留;且相较于ICG组及ICG@ZIF-8组,ICG-NPs组在肿瘤区域具有更为明显的富集。(3)第三部分AE-NPs体内抗GBM效应及机制研究:给药一周后,对照组(Con)、NPs组、AE@ZIF-8组和AE组中GBM荧光持续增加,尤其是Con组,相比之下,AE-NPs组则持续下降;与其他四组相比,AE-NPs更明显的减轻肿瘤体积和重量(P<0.05),显示更长的生存时间;HE染色显示,所有处理组均发生了肿bioactive packaging瘤坏死,但在AE-NPs组更为明显;Ki-67染色显示AE-NPs处理的GBM组织显示较低的Ki-67表达;westren blot结果显示:与其他四组相比,AE-NPs明显增强了CASP3和GSDME的激活。流式细胞术显示:与Con组比较,AE组、AE@ZIF-8组和AE-NPs组CD8~+T表达水平显著提高,AE-NPs组CD8~+T细胞与CD3~+T细胞之比由31%提高到64%。CD4~+T比例从71.45%增加到86.18%,Treg细胞无明显差异,F4/80~+CD86~+细胞与F4/80~+细胞之比从Con组的54%增加到AE-NPs组的71%;免疫荧光也显示AE-NPs组肿瘤中CD8~+T、Iba1~+和CD86~+细胞表达更明显;Rt-q PCR显示AE-NPs组IFN-γ、HMGB1、TNF-αm RNA表达较对照组增加6-17倍(4)第四部分AE-NPs体内外安全性:体外结果显示NPs制备主要材料体外无明显细胞毒性;荷瘤小鼠体内结果显示:在AE和NPs处理组中,ALT、AST、BUN明显增加,而γ-GT和CRE没有变化。组织病理学结果显示:在AE处理组的肝脏中检测到局灶性坏死,而在NPs和AE-NPs处理组中则未见相关损伤病灶,各组动物脑、心、肾、脾、肺均未见明显损伤灶。健康小鼠体内结果显示:NPs对小鼠体重、生存率、组织病理无影响,可引起ALT轻度升高。结论(1)AE通过激活ROS介导CASP3/GSDME通路促进GBM细胞焦亡发挥对GBM细胞的杀伤作用。(2)GSDME在GBM及其细胞系中高度表达,GSDME可能是抗GBM治疗的良好靶点。(3)本课题组构建的AE-NPs载药纳米系统具有理想的粒径及表面电荷,在肿瘤p H微环境中响应性释放,能增强细胞内摄入和颅内分布,增强肿瘤靶向性。(4)AE-NPs增强了AE的抗GBM效应,延长荷瘤小鼠生存时间,促进GBM细胞焦亡,增强CD8~+T、CD4~+T和M1型巨噬细胞的肿瘤浸润,增加抗肿瘤免疫细胞因子IFN-γ、HMGB1和TNF-α的表达,激活原位胶质瘤免疫微环境。(5)AE-NPs可减轻荷瘤小鼠AE相关肝肾生化学改变及肝脏组织损伤,纳米载体NPs对健康小鼠安全性良好。