在妇科肿瘤中,OC因其晚期诊断、短期复发、易化疗耐药等特点,导致OC为死亡率最高的妇科恶性肿瘤~([1,2])。目前,卵巢癌的标准治疗包括肿瘤细胞减灭术,根据分期给以铂联合紫杉醇化疗,根据患者临床分期、初始治疗药物使用、基因状态,部分患者给予PARPi单药/联合贝伐株单抗维持治疗~([3])。虽然OC患者经规范的一线治疗,延长了部分患者的无进展生存期或延迟了复发,但OC的复发仍然难以避免~([2,4])。目前,70%的EOC患者初始治疗后三年之内复发~([2])。随着复发次数的增多、间隔缩短,患者最终由化疗敏感变成耐药,而类耐药是导致治疗失败的关键因素~([4,5]),迄今为止尚无针对化疗耐药患者有效的治疗方案。本研究从协同顺铂杀伤OC细胞和耐药细胞代谢组学改变两个角度分别对OC进行探究。第一部分主要探讨西达本胺通过靶向能量代谢协同顺铂杀伤卵巢癌细胞,第二部分旨在讨论卵巢癌耐药细胞的代谢组学研究。为OC患者治疗和克服耐药提供新的思路和策略。第一部分西达本胺通过靶向能量代谢协同顺铂杀伤卵巢癌细胞背景:卵巢癌(Ovarian cancer,OC)是全球女性肿瘤死亡的第8大原因、死亡率高居妇科肿瘤之首,其病理类型以上皮性为主(约90%)。在大多数上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer,EOC)中,表观遗传变化明显,组蛋白脱乙酰酶(HDACs)的过表达是重要的表现。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor,HDACi)改变正常和转化细胞中的组蛋白去乙酰化,破坏癌细胞的周期和激活细胞凋亡,从而起到抗肿瘤作用。最近研究显示,HDACi可以通过作用于糖酵解和氧化途径的单个或多个酶来影响增殖。体内、体外实验及临床试验表明,HDACi可能是具有广泛应用前途的抗肿瘤药物,已证明对OC具有抗癌作用。西达本胺(Chidamide,Chi)是一种新型苯甲酰胺HDAC抑制剂,能选择性抑制HDAC1、2、3、10。目前,Chi正在美国和中国进行用于治疗包括OC等多种实体瘤的临床试验。虽然之前的体内、体外实验研究表明,HDACi与卡铂联合治疗具有协同抗肿瘤作用,但Chi对OC的作用效果及机制研究不足,尚未明确Chi与OC一线化疗药物顺铂(cisplatin,CDDP)联合治疗是否具有协同效果,需要更多基础研究支持相关临床试验。本研究进一步探索Chi、CDDP单药或联合对卵巢癌增殖、凋亡、代谢的影响。以卵巢细胞系A2780(BRCA野生型)和COV362(BRCA突变型)为模型,观察Chi、CDDP单药及联合于体内、体外对卵巢癌细胞生长的影响及机制进行探索;并以糖酵解、线粒体压力变化为基础,研究Chi、CDDP单药及联合于体外对卵巢癌细胞系A2780及COV362能量代谢的影响,发现Chi、CDDP联合治疗调控代谢酶转录,CDDP、Chi联合治疗特异性增强PDK4表达抑制OXPHOS;进一步研究发现PDK4的表达诱发OC细胞代谢重编程,影响OC细胞克隆、迁移、侵袭及对Chi、CDDP敏感性,为OC患者治疗提供新的思路和策略。目的:1.明确Chi+CDDP对OC细胞是否具有协同作用;探索Chi、CDDP单药及联合对OC细胞增殖、凋亡的影响,并于体内实验进一步验证;2.明确Chi、CDDP单药及联合对OC细胞代谢的影响;3.探索Chi、CDDP联合对OC细胞代谢酶转录影响,发现特异性改变PDK4转录及翻译;4.探索PDK4对OC细胞的生物功能及代谢的影响;5.体内实验验证PDK4对OC细胞增殖、药物敏感性影响。方法:1.采用CCK-8法分别检测CDDP、Chi对A2780、COV362的抑制作用,用细胞抑制率与剂量浓度作图,并求出各自IC50值;2.选取CDDP、Chi不同低浓度做联合实验,用金式公式计算其联合用药的Q值,根据Q值判断CDDP、Chi联合用药对OC细胞的作用;3.利用Agilent Seahorse XF能量代谢检测技术检测CDDP、Chi单药及联合作用后A2780、COV362细胞糖酵解压力及线粒体压力变化;4.利用Western Blot技术检测CDDP、Chi单药及联合作用后A2780、COV362细胞线粒体损伤、凋亡、糖代谢相关蛋白的表达水平;5.应用q-PCR技术检测CDDP、Chi单药及联合作用后A2780、COV362细胞糖代谢相关的蛋白的m RNA表达情况;6.使用慢病毒感染的方法对OC细胞敲减/过表达PDK4,利用Agilent Seahorse XF能量代谢检测技术检测PDK4表达对OC细胞能量代谢影响;7.探究PDK4的敲减/过表达对OC细胞克隆、迁移、侵袭及凋亡的影响;8.利用Western Blot技术检测OC细胞中敲减/过表达PDK4后糖代谢、Akt-m TOR信号通路、凋亡通路相关蛋白的表达水平;9.利用BALB/c雌性小鼠皮下移植A2780-OE-PDK4,A2780-KD-PDK4细胞来建立OC移植瘤模型,随机分,给予药物治疗,停药后观察各组小鼠生存期。结果:1.Chi、CDDP对卵巢癌细胞具有抑制增殖作用;Chi联合CDDP对卵巢癌细胞增殖抑制和促凋亡具有协同作用;体内实验显示,Chi联合CDDP可以延长OC种植瘤模型小鼠的生存期;2.Chi联合CDDP抑制OC细胞能量代谢,显著降低糖酵解和线粒体压力代谢;3.Chi联合CDDP,激活线粒体凋亡途径,降低糖酵解途径蛋白表达,下调p-m TOR、c-Myc表达;4.Chi联合CDDP影响代谢酶转录,增强PDK4表达抑制OXPHOS;5.PDK4过表达增强OC细胞的克隆、侵袭及迁移能力;敲减PDK4可导致OC细胞克隆、侵袭及迁移能力减弱;6.PDK4过表达在体外、体内增强OC细胞对CDDP耐药性,并下调线粒体凋亡途径;7.PDK4过表达上调OC细胞的能量代谢,糖酵解能力升高;敲减General EquipmentPDK4下调OC细胞多个糖代谢蛋白表达、能量代谢能力减弱,糖酵解能力显著降低;OXPHOS的变化在细胞间存在差异,可能与BRCA突变有关;8.PDK4过表达可激活OC细胞Akt-m TOR信号通路;在PDK4敲减细胞中,下调p-m TOR,上调LC3Ⅱ/LC3Ⅰ。结论:1.Chi联合CDDP在体内、体外对OC细胞具有协同抑制增殖和促凋亡作用;2.Chi联合CDDP降低OC细胞糖酵解能力,可能与糖酵解相关蛋白、p-m TOR、c-Myc表达下调有关;3.Chi联合CDDP影响代谢酶转录,增强PDK4表达抑制OXPHOS;并通过激活线粒体凋亡途径来诱导肿瘤细胞凋亡;4.PDK4的表达影响OC细胞体外克隆、迁移、侵袭能力,并影响细胞对CDDP的化疗药物的敏感性及CDDP引起的线粒体凋亡途径;5.敲减PDK4表达抑制OC细胞糖酵解限速酶表达、抑制能量代谢、糖酵解能力显著减弱;PDK4过表达引起OC细胞的能量代谢升高,糖酵解能力显著升高;OXPHOS的变化在细胞间存在差异,可能与BRCA突变有关;6.PDK4对OC细胞生物功能的调节,可能与PI3K/Akt信号通路有关。第二部分卵巢癌耐药细胞的代谢组学研究背景:卵巢癌(Ovarian cancer,OC)在女性生殖系统肿瘤发病率位于第三,但却是女性生殖系统死亡率最高的恶性肿瘤。目前,美国国家综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network(?),NCCN(?))对于OC提出的标准治疗方案是肿瘤细胞减灭术,根据术后病理分期给予以铂为基础联合多烯紫杉醇全身周期性化疗3-6个疗程,根据患者基因状态及临床分期、周期性化疗期间是否联合血管抑制剂等综合因素,化疗结束后给予聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶抑制剂(poly-ADP-ribose polymerase inhibitor,PARPi)单药/联合贝伐珠单抗维持治疗。即使经过手术、化疗、靶向药物维持治疗等规范治疗,OC的复发仍然难以避免,复发、耐药的产生是OC患者治疗失败、高死亡率的主要原因,但导致其复发、耐药的机制尚不明确。癌细胞的一个标志性特征是能MEK抑制剂够重新编程新陈代谢以维持肿瘤生长的有利环境。OC是一种异质性肿瘤,不同病理类型呈现不同的代谢特征,对于耐药性卵巢癌,代谢变化更加复杂,同时代谢途径对癌细胞的生长、耐药、转移起着重要作用。因此,揭示OC耐药细胞代谢重编程的分子机制是亟待解决的问题之一;对OC的治疗及预后具有非常重要的意义。代谢组作为继基因组学、转录组学、蛋白组学之后的又一新兴学科,是指存在于细胞、组织、器官或生物体内并具有广泛功能的代谢物的总数。代谢物不但是细胞代谢的产物和底物,也反映了与肿瘤发生、发展相关的细胞功能的变化,如细胞增殖、凋亡、转移。因此,代谢物水平的变化可作为诊断、预后标志物,也可作为治疗靶点。本研究通过构建卵巢癌细胞A2780对顺铂(Cisplatin/CDDP)耐药细胞ARC、对紫杉醇(Paclitaxel/PTX)耐药细胞ARP、对奥拉帕利(Olaparib/Ola)耐药细胞ARO的耐药细胞模型。运用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UHPLC-Q-TOF-MS)进行非靶向代谢组学检测,并对差异性代谢物进行生物信息学的功能分析,探索ARC、ARP、ARO细胞耐药的代谢机制,为逆转卵巢癌一线化疗药物及靶向维持药物耐药提供新的思路和策略。目的:1.构建A2780的顺铂耐药细胞ARC、紫杉醇耐药细胞ARP、奥拉帕利耐药细胞ARO的耐药细胞模型,在此基础上,探索CDDP、PTX、Ola耐药的分子机制;2.明确CDDP暴露对A2780和ARC细胞代谢的影响;PTX暴露对A2780和ARP细胞代谢的影响;Ola暴露对A2780和ARO细胞代谢的影响;3.探索CDDP、PTX、Ola暴露对A2780和耐药细胞差异代谢物富集通路的影响,分析耐药代谢标记物、通路以及潜在的逆转耐药的通路。方法:1.通过浓度梯度递增法构建A2780细胞对卵巢癌一线化疗药物(顺铂、紫杉醇、奥拉帕利)的耐药细胞,分别简称ARC、ARP、ARO;2.采用CCK8检测,A2780、ARC、ARP和ARO细胞对CDDP、PTX及Ola的IC50值,计算耐药指数;通过细胞增值实验、生长曲线、克隆实验及凋亡实验,验证耐药细胞的耐药性及稳定性;3利用UHPLC-Q-TOF-MS技术检测A2780、ARC及CDDP处理A2780(A2780-CDDP)和ARC(ARC-CDDP)组间差异代谢物;并对差异性代谢物进行生物信息学的功能分析;4.利用UHPLC-Q-TOF-MS技术检测A2780、ARP及PTX处理A2780(A2780-PTX)和ARP(ARP-PTX)组间差异代谢物;并对差异性代谢物进行生selleck抑制剂物信息学的功能分析;5利用UHPLC-Q-TOF-MS技术检测A2780、ARO及Ola处理A2780(A2780-Ola)和ARO(ARO-Ola)组间差异代谢物;并对差异性代谢物进行生物信息学的功能分析。结果:1.成功构建耐药细胞ARC、ARP、ARO,耐药细胞系增殖减慢;分别对CDDP、PTX、Ola引起的增殖抑制、促进凋亡作用敏感性降低;2.对ARC vs A2780及ARC-CDDP vs A2780-CDDP的差异代谢物进行鉴定、互作分析,结合KEGG分析结果,鉴定出A2780对顺铂耐药代谢标记物为N-(十八烷基)-鞘-4-烯嘌呤-1-磷酸胆碱,UDP-N-乙酰葡糖胺,L-瓜氨酸,DL-脯氨酸,UDP-半乳糖,缬氨酸;顺铂耐药通路有丙氨酸代谢,中枢碳代谢,嘧啶代谢,氨基糖和核苷酸糖代谢,谷氨酸代谢,精氨酸代谢,天门冬氨酸代谢,m TOR信号通路,ABC转运蛋白通路;3.对ARC vs A2780及ARC-CDDP vs A2780-CDDP的差异代谢物进行KEGG分析仅在顺铂暴露组异常富集的通路:乙醛酸和二羧酸代谢,2-氧代羧酸代谢,苯丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和色氨酸和脯氨酸代谢和鞘脂信号通路;4.对ARP vs A2780及ARP-PTX vs A2780-PTX的差异代谢物进行鉴定、互作分析,结合KEGG分析结果,鉴定出A2780对紫杉醇耐药的代谢标记物为异亮酰脯氨酸,脱氧肌苷,脱氧胸苷,肌醇,烟酰胺;紫杉醇耐药通路有丙氨酸代谢,谷氨酸代谢,天冬氨酸代谢,嘧啶代谢,半乳糖代谢,苯丙氨酸代谢,ABC转运蛋白,神经活性配体-受体相互作用通路;5.对ARP vs A2780及ARP-PTX vs A2780-PTX的差异代谢物进行KEGG分析仅在紫杉醇暴露组异常富集的通路:磷酸戊糖途径,氨基糖和核苷酸糖代谢,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,精氨酸生物合成,嘌呤代谢和鞘脂信号通路;6.对ARO vs A2780及ARO-Ola vs A2780-Ola的差异代谢物进行鉴定、互作分析,结合KEGG分析结果,鉴定出A2780对奥拉帕利耐药的代谢标记物为N-乙酰天冬氨酸谷氨酸,N-乙酰基-L-天冬氨酸-L-谷氨酸,吡啶,乙酰胆碱,L-棕榈酰肉碱,肌醇,烟酰胺;奥拉帕利耐药通路有中枢碳代谢,丙氨酸代谢,谷氨酸代谢,苏氨酸代谢,天冬氨酸代谢,丝氨酸代谢,癌症中的胆碱代谢,甘油磷脂代谢,神经活性配体-受体相互作用,ABC转运体通路;7.对ARO vs A2780及ARO-Ola vs A2780-Ola的差异代谢物进行KEGG分析仅在奥拉帕利暴露组异常富集的通路:淀粉和蔗糖代谢,半乳糖代谢,2-氧代羧酸代谢通路,牛磺酸和次牛磺酸代谢,泛酸盐和辅酶A的生物合成。结论:1.耐药细胞ARC、ARP、ARO共有耐药代谢标记物肌醇、烟酰胺;共性耐药通路包括中枢碳代谢,丙氨酸代谢,谷氨酸代谢,天冬氨酸代谢ABC转运体通路,神经活性配体-受体相互作用通路;共性潜在逆转耐药通路2-氧代羧酸代谢通路、甘氨酸代谢、鞘脂信号通路、丝氨酸代谢、苏氨酸代谢;2.A2780顺铂耐药的特异性通路有m TOR信号通路,氨基糖和核苷酸糖代谢,谷氨酸代谢,精氨酸代谢,天门冬氨酸代谢;逆转A2780顺铂耐药的潜在通路有苯丙氨酸,酪氨酸,脯氨酸,色氨酸,乙醛酸和二羧酸代谢;3.A2780紫杉醇耐药的特异性通路有半乳糖代谢,苯丙氨酸代谢;逆转A2780紫杉醇耐药的潜在通路有氨基糖和核苷酸糖代谢,精氨酸代谢,磷酸戊糖途径,嘌呤代谢;4.A2780奥拉帕利耐药特异性通路有癌症中的胆碱代谢,甘油磷脂代谢,丝氨酸代谢,苏氨酸代谢;逆转A2780奥拉帕利耐药的潜在通路半乳糖代谢,淀粉和蔗糖代谢,泛酸盐和辅酶A的生物合成,牛磺酸和次牛磺酸代谢。