研究背景分泌性中耳炎(Otitis media with effusion,OME)是以鼓室积液为特征的中耳非化脓性炎性疾病,又称为渗出性中耳炎、鼓室积液、卡他性中耳炎、浆液性中耳炎等,在很多患者中可同时伴有传导性听力下降。分泌性中耳炎可分为急性分泌性中耳炎与慢性分泌性中耳炎,是耳鼻咽喉科、全科医学及儿科临床工作中常见疾病之一。成人及儿童均可发病,但以儿童多见。在儿童患者中其发病率仅略低于上呼吸道感染,是儿童最常见的疾病之一。国外学者曾做过研究调查,通过对健康儿童的鼓膜常规筛查发现,15%至40%的1至5岁儿童患有无症状的OME,这些患者中91%在2岁以内至少有过一次OME急性发作史。OME患者的治疗不及时或者治疗不当,可能会导致鼓膜和中耳的病理变化,如粘连性中耳炎、鼓室硬化、中耳胆脂瘤等,从而使患者面临听力损失的风险,进而可能导致患儿的语言发育延迟。但目前OME的发病机制依然不明确,对OME的发病机制进行深入研究、探索其可能的治疗模式、寻找新的治疗靶点具有重要的临床意义。分泌性中耳炎的发生与多种因素密切相关。咽鼓管(Eustachian tube,ET)的机械性阻塞或功能障碍被认为是OME的重要发病原因之一,感染及免疫反应与OME发病也逐步受到学者的关注。咽鼓管是连通鼓室和鼻咽部的一条狭长通道。咽鼓管功能障碍(Eustachian tube dysfunction,ETD)会导致鼻咽部空气无法进入鼓室腔,使得中耳处于负压状态中,过久的负压状态会影响鼓室粘膜的气体交换,导致粘膜缺氧,血管通透性增加,进而诱发中耳出现渗出液。表面张力是影响咽鼓管功能的重要因素之一。表面张力存在于气体和液体分界处的液体表面,由于液体分子之间的吸引力,使液体表面产生极其微小的拉力,液体的这一拉力称为表面张力。表面张力广泛存在于自然界及人体中,在人体体液如胃液、尿液、消化液、中耳和肺泡内衬层的液膜都有表面张力的存在,对人体有着极其重要的作用。目前研究认为OME的发生发展与咽鼓管的正常开放与否密切相关,而表面张力的变化对于咽鼓管的开放很可能具有直接相关性。表面张力是一个动态变化的过程,受表面活性物质的精确调控。人体中的表面活性物质是磷脂与蛋白质的复杂混合物,具有降低气-液界面表面张力的特性确认细节。表面活性蛋白A(Surfactant protein A,SPA)是表面活性物质的主要蛋白质成分,也是肺表面活性物质中含量最丰富的非血清蛋白。SPA可以影响表面活性物质的动态平衡,促进脂质的物理结构发生改变,调节表面活性剂的功能和代谢。SPA在许多身体机能中起着至关重要的作用,但它在OME中的作用却很少受到关注。免疫因素是OME发病机制中的另一研究热点。变态反应及其相关疾病被认为是OME最重要的病因之一。儿童OME患者伴有过敏性鼻炎的患病率高达82%-93%。OME的免疫机制复杂多样,在不同的中耳积液中(如浆液性积液、粘Molecular Biology Reagents液性积液)炎性介质变化不同,相应的免疫机制也不相同。SPA与宿主的免疫机制及防御细胞密切相关,可通过多种细胞途径促进或抑制免疫细胞活性。SPA是巨噬细胞功能的重要调节者,可以改变巨噬细胞的生物学功能[1,2]。同时,另有学者发现巨噬细胞是体内表面活性物质中磷脂合成和分解的主要贡献者,显著影响表面活性物质的代谢。本研究旨在探讨SPA在OME发生发展中的作用及相关的分子机制。通过构建实验性的OME小鼠模型,检测SPA在分泌性中耳炎咽鼓管组织及分泌物中的表达变化,同时探讨咽鼓管表面张力的改变以及SPA对巨噬细胞迁移的影响。深入研究SPA与OME的关系,对于明确SPA在人体中的作用具有重要意义,有助于进一步了解OME发生发展的机制,为临床工作中OME的预防和治疗提供新的理论依据。研究方案及研究成果第一章:利用灭活肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)建立OME小鼠模型。研究方案:使用体重约15-20 g的健康BALB/c小鼠,经外耳道行鼓室注射灭活S.pn(5μl/耳)构建OME模型。对照组注射磷酸盐缓冲盐水(PBS,5μl/耳)。通过显微镜或耳纤维内窥镜观察鼓膜形态,利用听觉脑干诱发电位(Auditory brainstem response,ABR)及鼓室计评估造模小鼠听力水平及鼓室压力的变化,进一步验证模型构建成功。应用HE染色检测S.pn建立的OME模型的生物学特点。研究结果:1.S.pn建立的OME模型构建成功,显微镜下可以观察到鼓膜充血及鼓室积液。HE染色可见OME组鼓室粘膜增厚。对照组(PBS组)鼓膜及鼓室无明显变化。2.听功能测试结果提示OME组小鼠ABR检测阈值升高,同时伴有鼓室负压状态,差异具有统计学意义。结论:利用灭活肺炎链球菌建立BALB/c小鼠OME模型,通过观察实验组与对照组有无鼓室积液,ABR变化,鼓室压力差异,HE染色等,明确模型构建成功。第二章:探讨小鼠咽鼓管表面张力及SPA表达的变化。研究方案:分组及造模方法同第一部分。取各组造模成功小鼠(造模第3天)咽鼓管组织,利用TACLIS界面流变仪测量冲洗液表面张力的变化。同时利用ELISA,Real-time PCR,Western blot及免疫荧光共聚焦显微镜技术观察OME小鼠与对照组小鼠咽鼓管组织中SPA的表达变化。分析两者的相关性。研究结果:1.界面流变仪测试结果表明,OME组小鼠咽鼓管冲洗液的表面张力明显高于对照组,将两组表面张力数值比较,差异有统计学意义(P=0.014)。2.ELISA,Real-time PCR,Western blot及免疫荧光实验表明,SPA在 OME小鼠咽鼓管组织中的表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.001)selleck产品。3.表面张力与SPA的表达呈负相关(r=-0.525,P=0.037)。结论:1.OME小鼠咽鼓管冲洗液中SPA表达下降伴随表面张力升高,两者之间具有相关性,表明咽鼓管中SPA可能引起表面张力变化,进而影响咽鼓管的开放过程。2.OME小鼠咽鼓管组织中SPA表达下降,改善咽鼓管SPA表达可能是OME的潜在治疗靶点。第三章:明确SPA对巨噬细胞迁移的影响及其可能的作用机制。研究方案:有研究表明巨噬细胞对表面活性物质的分解与合成具有重要作用。Transwell实验检测SPA对巨噬细胞迁移的影响。RNA-seq分析预测SPA作用后巨噬细胞相关基因的表达变化,Western blot进一步验证RNA-seq的预测结果,明确SPA对巨噬细胞迁移的分子机制。研究结果:1.不同浓度的SPA作用于巨噬细胞后,巨噬细胞的迁移能力均明显增强。迁移能力的变化与SPA的浓度密切相关。2.RNA-seq共检测到13973个基因,分析和筛选研究组和对照组之间的差异表达基因(Differentially expressed genes,DEG)共有 5772个,其中 2952个基因表达上调,2770个基因表达下调。其中与巨噬细胞迁移密切相关的Rho GTPase的三个亚家族蛋白(Rac1/2/3、RhoA、Cdc42)均为差异基因(P<0.05)。3.Western blot进一步对Rho GTPase的三个亚家族蛋白的变化进行验证,结果显示SPA可能通过Rac1/2/3和RhoA影响巨噬细胞的迁移。Cdc42在不同浓度SPA作用后的巨噬细胞中的表达没有显著变化。结论:1.SPA对巨噬细胞具有趋化作用;但是当SPA浓度超过一定阈值时,对巨噬细胞的趋化作用将相对受限。2.SPA与巨噬细胞共培养后,Rac1/2/3和RhoA的表达发生变化,Cdc42的表达没有显著差异。因此,SPA可能通过Rac1/2/3和RhoA影响OME小鼠ET中巨噬细胞的迁移。拟解决的科学问题1.如何高效构建模拟人类分泌性中耳炎的小鼠模型,该模型能否适用于对分泌性中耳炎发病机制的研究?2.建立的分泌性中耳炎模型是否能够观察到SPA表达的变化,SPA的这种变化是否会影响OME的发生发展?3.SPA在OME中的作用是否与巨噬细胞相关,可能的作用机制是什么?