研究表明皮肤组织中也存在着局部肾素-血管紧张素系统(RAS),参与到伤口愈合、炎症、银屑病、衰老等多种皮肤生理和病理活动调控中。血管紧张素转化酶(ACE)在RAS的调控中发挥核心作用,部分ACE抑制剂也被发现能够改善瘢痕、皮肤光老化等问题,但是这类药物合成的ACE抑制剂存在着较为严重的副反应。因此从食源蛋白质中开发天然ACE抑制肽,为ACE的抑制剂的应用提供了新的方向。本课题以螺旋藻蛋白为原料,通过蛋白酶水解制备螺旋藻ACE抑制肽,结合肽组学和计算模拟的方法,从中筛选具有ACE抑制活性的活性肽。以L929细胞为模型结合蛋白组学探究其生物活性。同时对所获得的ACE抑制肽的安全性与稳定性进行评价。具体的研究内容如下:(1VX-445)依据水解度、ACE抑制率以及DPPH清除率,从碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶四种不同来源的蛋白酶中筛选最佳的螺旋藻蛋白水解酶制备ACE抑制肽,结果表明碱性蛋白水解酶产物具有最高的水解度、ACE抑制率和DPPH清除率。LC-MS/MS并结合数据库对螺旋藻碱性蛋白酶水解液肽段进行分析,共鉴定出782条肽段。采用药效团模型和分子对接对进行分析,筛选出两种新型ACE抑制肽HIIARPH和LRLKE,IC_(50)分别为461.5μmol/L和155.8μmol/L。Lineweaver-Burk双倒数作图法表明HIIAntipseudomonal antibioticsARPH和LRLKE的抑制类型皆为非竞争性抑制。(2)通过Western Blot确定Ha Ca T、NIH 3T3、L929细胞都能表达ACE,皮肤成纤维细胞L929表达量最高并被选为研究对象。采用MTT法对HIIARPH和LRLKE细胞毒性进行检测,在1.0 mmol/L浓度下,两种抑制肽对L929细胞无明显毒性。通过LPS刺激L929细胞建立炎性衰老模型,并采用RT-PCR对ACE和AT_1R的m RNA表达进行检测,采用Western Blot对ACE和Ang II的蛋白表达进行检测、采用ELISA对培养上清中的Ang II进行检测。结果表明LPS能够激活RAS,增加ACE/Ang II/AT_1R通路的m RNA和蛋白表达并确定LPS刺激细胞浓度为1.0μg/m L。分别用不同浓度HIIARPH、LRLKE的处理LPS刺激的L929细胞,并对细胞内SOD和CAT酶活性进行检测。结果表明HIIARPH和LRLKE都能提高抗氧化酶SOD和CAT的酶活性,且LRLKE的抗氧化能力优于HIIARPH。采用ELISA检测细胞衰老相关分泌表型(SASP)IL-6的分泌情况,发现HIIARPH和LRLKE能减少IL-6的分泌。采用1.0 mmol/L的HIIARPH和LRLKE分别处理细胞研究其对RAS的影响,并采用ELISA对培养上清中的ACE活性进行检测,采用RT-PCR对ACE、AT_1R以及AT_2R的m RNA表达进行检测,采用Western Blot对ACE和AT_1R的蛋白表达进行检测。结果表明,HIIARPH和LRLKE都能抑制胞外ACE的活性,抑制RAS中ACE/Ang II/AT_1R通路,而LRLKE能进一步激活AT_2R。(3)通过蛋白质组学进一步分析了LRLKE在LPS诱导的L929细胞中参与调控的蛋白差异表达情况。研究结果验证了LRLKE参与调控了L929多种信号通路如细胞衰老、p53、NF-κB、病毒感染、铁死亡、自噬等。同时根据蛋白富集分析等结果,通过Western Blot和ELISA对细胞衰老、细胞凋亡信号通路中的差异蛋白进行验证。实验证明蛋白组学数据可靠具点击此处有可参考价值,LRLKE通过ACE/AT_1R/NF-κB/IL-6通路参与调控细胞炎性衰老,ACE/AT_1R/Bcl-2/Bax或者ACE/AT_1R/Bid/Bax调控细胞凋亡过程。(4)对1.0 mmol/L的HIIARPH和LRLKE分别进行安全性测试。采用直接多肽反应(DPRA)对两种ACE抑制肽的致敏性进行测试;采用鸡胚绒毛尿囊膜实验(HET-CAM)和小鼠红细胞溶血对两种ACE抑制肽的刺激性进行测试;采用艾姆斯(Ames)实验对两种ACE抑制肽的致突变性进行测试;采用人体斑贴实验进行人体安全性测试。结果表明1.0 mmol/L浓度下的HIIARPH和LRLKE无刺激性、致敏性以及致突变性,对人体安全。(5)对HIIARPH和LRLKE的温度、p H以及存储稳定性进行测试,结果表明,LRLKE具有较好ACE抑制活性稳定性,温度以及p H的变化对其影响较小。而HIIARPH在温度>50℃以及p H<6时,活性显著降低。此外0℃和25℃条件下储存16天,对两种ACE抑制肽的抑制活性无显著影响。