酮病是奶牛在围产期高发的一种代谢性疾病。围产期奶牛由于能量摄入不能满足能量支出而引起能量负平衡(Negative energy balance,NEB)。严重NEB引起奶牛脂肪过度动员,进而导致肝脂蓄积和高酮血症,造成奶牛酮病的发生。酮病会增加奶牛继发其他疾病的风险,尤其是以乳腺炎为代表的感染性疾病,这与酮病导致的奶牛天然免疫抑制密切相关。中性粒细胞作为天然免疫的主要组成细胞,活跃在天然免疫的前Docetaxel使用方法线,其在抵御病原体入侵中发挥不可或缺的作用。研究表明酮病奶牛中性粒细胞的吞噬和形成胞外诱捕网的功能受到抑制,然而酮病是否影响中性粒细胞的趋化功能尚不清楚。本研究旨在探究奶牛酮病对中性粒细胞趋化的影响及其调控机制。(1)本研究首先对比了酮病和健康奶牛外周血中性粒细胞转录组的变化。转录组测序分析共鉴别出864个差异表达基因,表达上调基因有594个,表达下调基因有270个。GO富集分析结果显示生物过程term主要富集在中性粒细胞免疫应答、炎症反应、趋化反应、细胞钙信号、蛋白转运、细胞命运以及其他等方面;分子功能term主要富集在细胞趋化、蛋白活性以及Rho GTPase蛋白活性等方面;细胞组分term主要富集在细胞核、细胞质、核浆和细胞质溶胶。随后对GO数据集进行GSEA分析得到45个具有统计意义的term,通过对比发现,GO-GSEA term与GO富集分析term在免疫应答、炎症反应和趋化作用等方面存在较大重合,并且除了纤连蛋白结合term的标准化的富集分数(NES)为正值外,其余term的NES值均为负值,表示酮病奶牛中性粒细胞的免疫功能相关的生物过程可能整体处于抑制状态,这与酮病奶牛处于免疫抑制状态相一致。另一方面,KEGG富集分析结果显示差异表达基因主要富集于细胞趋化、粘附、凋亡、炎症、蛋白降解、免疫、代谢等相关信号通路方面。同样对KEGG数据集进行GSEA分析得到15个基因集,其中包括炎症相关通路(NF-κB信号通路、IL-17信号通路、Toll样受体)和肠道免疫网络Ig A生产等免疫相关信号通路,其中除醚脂代谢信号通路外其余信号通路NES值均为负值,说明酮病奶牛中性粒细胞的炎症反应和免疫功能相关调控信号通路均处于抑制状态,与上述受抑制的生物学过程结果一致,解释了酮病奶牛免疫抑制状态可能由中性粒细胞功能受损导致。值得注意的是,以上各部分分析均提示酮病奶牛细胞趋化功能受到损害。(2)本研究探究了酮病高β-羟丁酸(BHB)血症对奶牛中性粒细胞趋化的影响。扫描电子显微镜结果发现酮病奶牛中性粒细胞在趋化过程中呈现“巨尾”现象;Western blotting和荧光定量PCR结果显示酮病奶牛中性粒细胞尾部收缩效应分子MLC2的转录水平和蛋白磷酸化含量增加,提示以上“巨尾”表型与MLC2过度活化相关。体外使用3.0 mmol/L BHB模拟临床酮病状态selleck,分别刺激外周血分离的中性粒细胞3 h、6 h和9 h后进行诱导趋化,结果发现BHB抑制中性粒细胞趋化距离,且呈时间依赖性;Western blotting和荧光定量PCR结果发现BHB处理增加了上游蛋白激酶C(PKC)和下游MLC2的m RNA丰度和蛋白磷酸化水平,也增加了中游Rho A和ROCK1分子的表达;重要的是,PKC抑制剂Sotra可缓解以上BHB对细胞趋化和PKC信号通路的影响;另外,体外免疫荧光还发现Sotra逆转了BHBInfection génitale引发的奶牛中性粒细胞尾部MLC2的过度累积及其导致的“巨尾”表型。最后,体内验证发现酮病奶牛中性粒细胞PKC磷酸化水平显著高于健康奶牛。以上证据表明高BHB血症可通过激活PKC信号通路,引起下游MLC2的过度磷酸化和尾部积累,最终引起奶牛中性粒细胞趋化距离缩短。值得注意的是,BHB也会损害奶牛中性粒细胞趋化方向性,但并不受PKC信号的调控。(3)作为上部分的延续,本研究进一步探究了BHB调控奶牛中性粒细胞趋化方向性损害的分子机制。为精准分析趋化细胞运动状态,采用延时摄影记录中性粒细胞趋化过程,并用总趋化距离、趋化位移、平均趋化速度、平均位移速度和平均角度变化率五个参数评价中性粒细胞趋化的运动性和方向性。结果发现酮病奶牛中性粒细胞趋化运动性和方向性都受到抑制,这与部分(2)表型一致。另外,Western blotting和荧光定量PCR结果发现,BHB处理后,趋化方向关键效应分子Cdc42和Rac1的m RNA丰度降低,但蛋白总水平和活化水平升高;透射电子显微镜结果发现BHB处理降低奶牛中性粒细胞自噬体的数量,Western blotting结果发现BHB处理可增加细胞螯合体1/泛素结合蛋白(p62)的表达,而降低微管相关蛋白1A/1B-轻链3(LC3)-II的表达,说明BHB抑制中性粒细胞的自噬;以上结果表明BHB可能通过抑制自噬导致趋化方向关键效应分子Cdc42和Rac1的积累。为了验证这一猜想,体外使用BHB与自噬激活剂雷帕霉素(RAPA)共刺激,结果发现BHB对中性粒细胞趋化方向性的损害以及对Cdc42和Rac1蛋白累积的影响均显著缓解;同样,体内实验验证发现酮病奶牛Cdc42和Rac1蛋白丰度显著增加。以上结果证实了高BHB血症通过抑制自噬引起Cdc42和Rac1蛋白累积,最终导致酮病奶牛中性粒细胞趋化方向性的损害。总之,本研究发现,与健康奶牛相比,酮病奶牛中性粒细胞转录水平表现出免疫活性和功能降低的趋势;酮病奶牛的高BHB血症分别通过PKC-MLC2和自噬-Cdc42/Rac1信号通路损害中性粒细胞趋化的运动性和方向性。