目的胸腺是连接衰老和免疫的关键器官。本研究通过构建阿霉素(Adriamycin,ADM)诱导的急性胸腺退化小鼠及其器官模型,研究急性免疫衰老胸腺中的胸腺上皮细胞(Thymic epithelial cells,TECs)的空间分布异常现象,探讨传统中药当归中有效成分藁本内酯(Ligustilide,LIG)延缓胸腺免疫衰老的药效和作用机制。方法第一部分:腹腔注射ADM诱导小鼠胸腺急性退化,天突穴皮下或穴位注射藁本内酯干预。设置正常组、模型组、穴位/皮下注射PBS组,穴位/皮下+藁本内酯低、中、高剂量组(0.2、1、5 mg/kg)、雷帕霉素组(2 mg/kg i.p.)、盐酸二甲双胍组(200 mg/kg i.p.)。观察小鼠自主活动、抓力等衰老相关表征,检测胸腺部位微循环血流量;TRECs法检测胸腺输出功能;qPCR分析胸腺中irt6、P53、P21、PTMα、Tβ4、Tβ15、Tβ10mRNA表达;H&E和免疫荧光法观察胸腺结构及TECs分布;流式细胞术分析胸腺细胞亚群;Western Blot 法检测胸腺中 CYCLIN D1、α-TUBULIN、ECADHERIN、PROFILIN 2、P53蛋白表达。制备ADM诱导的胸腺上皮细胞衰老模型,0.01、0.1、1 μM藁本内酯干预。MTT法观察细胞存活率;β-半乳糖苷酶特异染色法检测细胞衰老;qPCR检测细胞中Sirt6、Sirt3、P53、P21,衰老相关分泌表型(Senescence-associated secretory phenotype,SASP)Il-1α、Il-1β、Il-6、Il-8、Hgf、Cxcl 9、Cxcl 2,以及 PTMα、Tβ4、Tβ15、Tβ10、Tα1、Ts1p mRNA表达水平;荧光标记F-actin和G-actin观察细胞骨架;Western Blot 法检测细胞中 CYCLIN D1、α-TUBULIN、VIMENTIN、ECADHERIN、PROFILIN 2、P53蛋白表达。采用ADM诱导小鼠离体胸腺衰老,上述方法观察胸腺结构、TECs分布以及T细胞亚群的变化。采用肌动蛋白聚合抑制剂、Tβ15和 Tβ4过表达腺病毒验证药物可能的作用机制。第二部分:采用Tβ15敲低和过表达技术干预胸腺组织,观察胸腺结构变化及TECs分布;免疫组化法检测胸腺中CD3、CD4、CD8、TCR β 表达;qPCR 检测胸腺中 Aire、Fezf2、L1cam、β2M H2-K1、Gi、map3、Gimap4 S1p1、CD69、Sp1、Icam-1、Vcam-1 mRNA表达水平;流式细胞术分析胸腺细胞亚群的变化。构建人工胸腺类器官并裸鼠腋下移植类器官;采用上述方法观察胸腺类器官结构、TECs分布和胸腺输出功能。敲低和过表达iTECs细胞的Tβ15验证Tβ15调控TECs空间分布的可能机制。结果第一部分:与正常组相比,模型组小鼠胸腺结构紊乱,胸腺输出加速(P<0.01),P53、P21水平增加(P<0.selleckchem05),Tβ4、Tβ15水平降低(P<0.01)。与模型组相比,穴位/皮下注射PBS组均降低胸腺输出功能(P<0.01),但穴位注射PBS组增加胸腺部位微循环血流量(P<0.05)、CD3+TCR β+和CD4SP T细胞比例(P<0.01);而皮下注射PBS组增加小鼠自主活动次数(P<0.01)。与对照组相比,穴位注射藁本内酯组小鼠皮髓质分界清晰,髓质网状上皮细胞数量增加,P53、P21水平降低,Tβ4、Tβ15水平升高,胸腺T细胞阳性选择过程恢复。皮下注射藁本内酯组相比对照组能增加小鼠体重、抓力及微循环血流量,降低P53、P21水平,增加胸腺哺育细胞数量及DPT细胞比例。ADM诱导的iTECs细胞经藁本内酯干预后衰老比例减少,微丝结构增加,P53、P21等衰老相关因子表达减少,PROFILIN2、α-TUBULIN、CYCLIND1蛋白表达增加。ADM诱导离体胸腺结构紊乱,TECs数量减少,DN T细胞发育受阻。藁本内酯逆转该过程,增加TECs数量和网状结构,促进DN向DP T细胞发育,增加CD3+TCRβ+和CD4SP T细胞比例。机制研究发现,ADM减少iTECs中的微丝,降低PROFILIN 2、CYCLIN D1、α-TUBULIN蛋白表达,增加Tβ4、Tβ15表达。藁本内酯通过调节Tβ4和Tβ15的表达,特别是Tβ15,平衡TECs的微丝组装。第二部分:Tβ15过表达时离体胸腺缩小,TECs数量减少,CD4SP T细胞比例降低,Aire、L1cam、51p1等mRNA水平降低。相反Genetic studies,Tβ15敲低促进胸腺萎缩(P<0.05)但扩张髓质,并逆转各项变化。人工胸腺类器官实验中,胸腺细胞与过表达Tβ15的iTECs细胞共培养的类器官体积更小(P<0.01),DNT细胞比例增加。敲低Tβ15使类器官增大,DNT细胞比例降低。移植Tβ15OX的胸腺类器官至裸鼠腋下,胸腺输出减少,T细胞分化速度加快。移植敲低Tβ15的胸腺类器官,类器官中TECs网状结构更加密集,并加速未成熟PLX-4720 IC50T细胞输出。Tβ15过表达不影响细胞迁移能力,但降低FGFR2Ⅲb、Leptin等表达,增加TNF-α、IL-1β等水平;敲低Tβ15增强iTECs增殖和迁移能力,并增加FGFR2Ⅲb、Leptin等表达,降低TNF-α、IL-1β等水平。过表达Tβ15的iTECs与胸腺细胞共培养抑制胸腺细胞增殖、促进凋亡,而敲低Tβ15促进胸腺细胞增殖、减少凋亡。结论藁本内酯能逆转阿霉素诱导的急性胸腺退化,可能具有抗胸腺免疫衰老的作用。这一作用与藁本内酯抑制Tβ15表达,减缓肌动蛋白的解聚过程,维持actin踏车行为的动态平衡有关。而Tβ15作为最强的肌动蛋白结合蛋白,在调节TECs微丝组装速率,维持TECs的正常形态和功能,稳定胸腺的结构和输出中发挥至关重要的作用。