水产养殖疫病频发,急需开发绿色抗菌制剂作Targeted biopsies为免疫增强剂减少产业损失。抗菌肽/蛋白因具有独特的杀菌机制且具有免疫调节功能,被认为是抗生素的良好替代品。然而,由于其使用成本高,在胃肠道易降解等原因限制了它在水产养殖中的广泛应用。因此,合适的蛋白表达系统与防降解制剂研发成为当下亟待解决的问题。前期,我们在草鱼的肠道中发现了一种新型抗菌selleck Liraglutide蛋白—白细胞衍生趋化因子2(Leukocyte-derived chemotaxin-2,LECT2),本研究通过毕赤酵母发酵表达了LECT2-b,作为饲料添加剂投喂了草鱼,发现LECT2-b可以显著提高草鱼对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的抵抗力。最后,为了克服抗菌蛋白易降解的缺点,我们利用羧甲基壳聚糖作为防降解载体负载了抗菌蛋白LECT2-b,制备了纳米颗粒,并评估了其理化特性、缓释性能和抗降解能力。具体研究结果如下:1.毕赤酵母表达的抗菌蛋白LECT2-b具有良好的抗菌活性。将密码子优化后的LECT2-b基因插入至毕赤酵母表达载体p PIC9K,并将其导入至KM71中,通过G418抗性平板筛选得到含表达载体拷贝数高的酵母菌株。将酵母连续培养96 h,并以甲醇作为碳源诱导蛋白表达,发现诱导LECT2-b表达的浓度为0.8%,pH为6.5-7。利用阳离子交换柱纯化上清中的目的蛋白,随后检测了LEBAY 73-4506体内实验剂量CT2-b的杀菌活性。结果显示,LECT2-b可以有效杀灭革兰氏阴性细菌。2.投喂LECT2-b可以显著提高草鱼对嗜水气单胞菌的抵抗力。为了探究抗菌蛋白LECT2-b的免疫预防效果,我们将抗菌蛋白LECT2-b作为饲料添加剂投喂了草鱼,然后用嗜水气单胞菌感染草鱼,统计草鱼死亡率并检测了免疫相关基因的表达水平(IL-1β、IL-2、LECT2-b、LEAP-1、β-defensin和IgT)。结果表明:LECT2-b组存活率提高了12%。此外,LECT2-b组可以通过调节和恢复脾脏与肠道组织中免疫相关基因(IL-1β、IL-2、LECT2-b、LEAP-1、β-defensin和Ig T)的m RNA表达,从而有效调节机体的免疫应答。由此可见,抗菌蛋白LECT2-b具有一定的免疫调节作用,可有效预防草鱼细菌性疾病。3.羧甲基壳聚糖(Carboxymethyl chitosan,CMCS)负载抗菌蛋白LECT2-b制备纳米制剂。利用CMCS作为抗降解载体负载抗菌蛋白LECT2-b,采用离子交换法制备了纳米颗粒CMCS-LECT2-b(CMCS-2b)。首先,我们对其进行了动态光散射分析,结果表明,CMCS-2b的平均粒径为199±6.6 nm,Zeta电位为-11.16±0.5 mV,PDI(Polymer dispersity index)指数为0.33±0.07,稳定性良好。通过透射电镜观察其形态特征,负载LECT2-b后形成的纳米颗粒呈较为规则球形。体外试验证明,纳米颗粒CMCS-2b结构稳定,且具备缓释性能,在与草鱼肠黏液共孵育后,CMCS-2b可在一定程度上抵抗酶的降解。总而言之,本研究通过毕赤酵母表达了草鱼抗菌蛋白LECT2-b,发现其作为饲料添加剂可以显著提高草鱼的抗病力。最后,通过离子交换法制备了可缓释、抗降解的纳米制剂CMCS-2b。这些结果为LECT2-b作为口服抗菌制剂的应用奠定了重要的基础。