植物类黄酮是一类具有多种生物活性的天然化合物,其在植物体内广泛存在于花、果实、叶子等组织部位。类黄酮化合物具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗衰老、降血压等生物活性,由于其独特的化学结构和生物活性,被广泛应用于食品、医药等领域。黄酮糖苷是一种类黄酮化合物与糖分子(如葡萄糖、半乳糖、鼠李糖等)通过糖苷键连接而成的化合物。它们在植物体内通常以稳定的形式存在,并且也是植物中类黄酮化合物的主要形式之一。而糖基转移酶是参与黄酮糖苷合成的关键酶类,其催化作用使不同的黄酮底物与不同的糖基结合形成黄酮糖苷。苦荞(Fagopyrum tataricum)是蓼科荞麦属一年生植物,作为一种重要的药食同源小杂粮作物,不仅含有丰富的营养物质,还富含具有生物活性的类黄酮化合物。目前,苦荞中已鉴定出近200种黄酮化合物,其中约一半为黄酮糖苷类化合物。在苦荞中,虽然已有部分糖基转移酶基因被鉴定,且其中少部分已功能证实催化了黄酮糖苷的生物合成,但对这六大类黄酮糖苷生物合成相关糖基转移酶的系统鉴定未见报道。因此,对苦荞中催化黄酮糖苷生物合成的这六大类糖基转移酶进行系统鉴定,尤其是鉴定与芦丁生物寻找更多合成相关的糖基转移酶,不仅可以完善苦荞芦丁生物合成途径,拓展人们对苦荞黄酮糖苷生物合成的认识,还能为今后高芦丁或高特异性黄酮糖苷苦荞分子育种提供理论依据和基因资源。本研究对苦荞糖基转移酶基因家族进行系统鉴定,同时通过系统进化分析、基因共表达、分子对接模拟等确定苦荞中参与六大类黄酮糖苷生物合成的候选糖基转移酶基因。本研究在此基础上,选择其中的候选基因进行克隆、构建表达载体、体外酶活功能验证。研究结果将进一步拓展人glandular microbiome们对苦荞黄酮糖苷生物合成的认识,为今后高芦丁或高特异性黄酮糖苷苦荞分子育种提供理论依据和基因资源。主要研究结果如下:1.利用生物信息学方法鉴定到苦荞糖基转移酶基因162个,发现其在染色体上分布不均匀,构建苦荞糖基转移酶基因家族与拟南芥UGTs家族成员的系统进化树,分析FtUGT的基因结构图、启动子顺式作用元件、共线性、选择压力进化分析、非生物胁迫响应及在不同组织部位的表达。结果发现,FtUGT基因家族在进化过程中具有多样性和复杂性,其中富含激素相关的反应元件和环境压力响应元件,MYB转录因子结合位点,这表明苦荞UGT基因家族的表达受到激素、环境压力和MYB转录因子等多个因素调控。2.利用最大似然法(ML)基于163个FtUGT序列和82个来自不同植物的已知的类黄酮UGT构建系统发育树,系统鉴定到苦荞六大类黄酮糖苷生物合成相关候选糖基转移酶。对FtUGT在转录水平与黄酮糖苷代谢物之间进行相关性分析,挖掘与黄酮糖苷代谢物形成相关的UGT基因。分析了40个类黄酮生物合成结构基因与126个FtUGT基因的表达相关性,进一步寻找与类黄酮生物合成相关的候选FtUGT基因。这为进一步研究苦荞中黄酮糖苷代谢物的生物合成提供了重要的基础数据。3.通过RT-PCR技术成功克隆到一个可能参与苦荞中黄酮C-糖苷生物合成的C-糖基转移酶基因FtUGT143,其编码蛋白序列由224个氨基酸残基组成;对FtUGT143的密码子偏好模式进行分析,对FtUGT143蛋白进行同源建模与分子对接模拟,结果显示FtUGT143能与合成C-黄酮糖苷牡荆素、异牡荆素、荭草素和异荭草素的底物木犀草素和芹菜素相互作用,表明FtUGT143可能参与苦荞中黄酮C-糖苷生物合成;荧光定量表达分析显示,FtUGT143主要在苦荞芽苗期的叶、茎和根中表达。为后续FtUGT143蛋白功能验证与定向突变提供了理论基础。4.通过RT-PCR技术成功克隆到一个参与苦荞中芦丁生物合成的关键糖基转移酶基因FtPLX-4720使用方法UGT163,对FtUGT163进行了序列分析,原核表达载体构建,原核表达蛋白表达与纯化,进行体外酶活实验测定。结果显示,FtUGT163具有糖基转移酶的活性,可以催化异槲皮素生成芦丁。这揭示了FtUGT163的催化机制,完善了芦丁生物合成的途径。