研究背景与目的:肝癌作为全球最致命的疾病之一,在中国尤其突出。传统抗癌药物如阿霉素、顺铂等,随hepatic diseases着用药时间的延长,其抗癌作用效果越不明显,很难达到预期治疗效果。因此,寻找针对肝癌的替代抗癌药物需求显得十分紧迫。苦瓜抗艾滋蛋白(MAP30,Momordica anti-HIV-1 Protein of 30 k Da)是从新鲜苦瓜籽仁中提取出的一种核糖体失活蛋白(Ribosome Inactivating Proteins,RIPs),具有抗肿瘤、抗病毒、抗细菌等多种生物学功能。在20世纪90年代由美国科学家Sylvia Lee-Huang et al.首次发现并报道其具有N-糖苷酶活性,并抑制蛋白质的生物合成。以往的研究主要集中在MAP30的结构分析和抗病毒活性方面,对其抗肿瘤作用效果的研究相对较少。本文作者在先前研究工作基础上,将几种纯化方法和层析技术有机结合,成功地从苦瓜籽中获得了符合实验Lorlatinib细胞培养要求的抗肿瘤蛋白MAP30,同时对该蛋白引起的细胞凋亡及相关凋亡信号通路和抗肝癌作用效果进行了初步探讨。所取得一些研究结果可为该蛋白作为潜在的抗肿瘤药物奠定了一定的理论和实验基础。材料与方法:一、MAP30的制备和鉴定以新鲜成熟的苦瓜籽为原料,根据MAP30的理化特征及相关文献报道资料,我们主要分别采用p H选择性变性沉淀、硫酸铵分级分离、离子交换层析、分子筛层析和疏水相互作用层析或SP-Sepharose离子交换层析与透析、超滤等方法有机结合来分离和纯化目标蛋白MAP30。通过酸性PAGE、SDS-PAGE、IEF、RP-HPLC、蛋白质氨基酸测序和MALDI-TOF/MS等方法对MAP30进行了鉴定。二、体外抗肝癌活性(1)不同浓度的MAP30(0.012,0.06,0.3,1.5 mg/mL)针对五种肝癌细胞株(Hep G2,MHCC-97H,MHCC-97L,HCC-LM3,SK-Hep-1),分别处理不同的时间(24 h,48 h,72 h),采用CCK-8试剂和细胞克隆形成实验评估肝癌细胞的增长抑制情况。(2)MAP30处理的细胞,经PI染料染色检测肝癌细胞周期。(3)MAP30处理的细胞通过倒置显微镜观察细胞生长状况、生长密度、细胞间隙等;细胞切片通过电镜观察用药后细胞器的变化情况。(4)流式细胞检测凋亡率,同时应用蛋白免疫印迹技术检测细胞内凋亡标志蛋白的激活情况。三、MAP30诱导肝癌细胞SK-Hep-1发生涉及线粒体的凋亡(1)DCFH-DA探针法检测MAP30处理后的细胞内ROS水平变化情况;(2)MAP30处理的细胞后线粒体膜电位的变化用JC-1染料检测;(3)蛋白免疫印迹检测细胞内线粒体凋亡相关蛋白Bcl-2,Bax,细胞色素C(Cytochrome c)表达情况。结果:1.通过粗提,酸化,硫酸铵分级沉淀,离子交换层析和分子筛层析等工序,从100g苦瓜籽中提取到63 mg MAP30,该纯化的MAP30在还原或非还原条件下,SDS-PAGE显示单一蛋白着色带,对应的分子大小约为30k Da,经MALDI-TOF/MS和N-末端氨基酸测序确定其为MAP30蛋白。2.体外实验研究表明,MAP30具有抗肝癌活性。用不同浓度的MAP30(0.012,0.06,0.3,1.5 mg/mL)处理不同肝癌细胞株(Hep G2,MHCC-97H,MHCC-97L,HCC-LM3,SK-Hep-1),均表现出显著抑制细胞生长的作用,尤其是HCC-LM3与SK-Hep-1细胞株,呈现明显的时间-剂量依赖性。细胞周期检测发现MAP30可以将Hep G2,MHCC-97H,HCC-LM3,SK-Hep-1阻滞在G0/G1期。3.通过电镜发现,MAP30可以使得HCC-LM3细胞发生凋亡。Annexin VFITC/PI双染色法和蛋白免疫印迹检测发现MAP30可以诱导SK-Hep-1和HCCLM3细胞发生凋亡,且随着用药剂量越大其凋亡率也越高,表现为凋亡蛋白Caspase-3,PARP1激活及Cleaved-Caspase-9明显上调。4.肝癌细胞株SK-Hep-1经MAP30处理细胞后,用DCFH-DA探针检测到细胞内ROS水平的增高,线粒体膜电位的降低(JC-1染料法),以及细胞内Bcl-2蛋白表达的下调。所有这些结果证明MAP30可以诱导肝癌细胞SK-Hep-1线粒体www.selleck.cn/products/Lapatinib-Ditosylate的凋亡。结论:改良后的MAP30分离纯化步骤得到简化,节约时间的同时也保证了MAP30的纯度。体外抗肿瘤实验表明其可以抑制Hep G2,MHCC-97H,MHCC-97L,HCCLM3,SK-Hep-1肝癌细胞株的增殖、诱导Hep G2,MHCC-97H,HCC-LM3,SKHep-1细胞G0/G1周期阻滞、增加细胞内ROS水平并促进涉及线粒体的细胞凋亡。所有结果表明,这种天然的MAP30在临床应用中可作为人类抗肝癌的新型潜在药物。