镍是环境中重要的污染物,对人和动物健康带来严重的危害。目前已证实镍具有多器官毒性,其毒性机制主要集中在氧化损伤、细胞凋亡、自噬、细胞周期抑制和内质网应激。铁死亡是一种新型的细胞死亡方式,且与自噬有密不可分的关系,已有研究表明铁死亡与多种金属诱导的毒性作用有关。目前,关于自噬依赖性铁死亡在氯化镍(NiCl_2)诱导肾毒性中的作用机制尚不清楚。因此,本试验选用7周龄ICR小鼠以及体外小鼠肾小管上皮细胞(TCMK-1)为试验对象,通过体内外NiCl_2染毒试验,探caecal microbiota讨铁死亡在NiCl_2诱导的肾脏细胞毒性中的作用,以及自噬在其中发挥的作用与机制,为镍肾毒性的研究提供新的理论基础。结果如下:1.NiCl_2诱导小鼠肾脏细胞和TCMK-1细胞铁死亡选用64只7周龄ICR雄性小鼠和TCMK-1细胞作为试验对象。体内试验分为0mg/kg、7.5 mg/kg、15 mg/kg和30 mg/kg 4个NiCl_2剂量组,连续PF-07321332 NMR灌胃28 d;体外试验分为0μM、200μM、400μM和800μM 4个NiCl_2剂量组,连续处理24 h。体内试验结果显示,NiCl_2处理组小鼠肾脏石蜡切片HE染色后肾小管上皮细胞出现空泡变性和颗粒变性,肾小球萎缩,以及肾小囊囊腔间隙变小;肾脏铁含量明显升高;透射电镜观察到肾脏近曲小管线粒体体积缩小;蛋白印迹和qRT-PCR结果显示铁死亡标志物COX-2表达水平显著升高,而SLC7A11和GPX4表达水平明显降低。结果表明NiCl_2可诱导小鼠肾脏铁死亡。体外试验结果显示,NiCl_2处理TCMK-1细胞后,细胞铁含量显著增加;透射电镜下观察到线粒体体积缩小;MDA含量升高、T-SOD活性和GSH含量明显下降;脂质活性氧绿色荧光明显增强;蛋白印迹和qRT-PCR结果显示COX-2蛋白和mRNA表达显著上调、而SLC7A11和GPX4表达显著下调。结果表明NiCl_2可诱导TCMK-1细胞铁死亡。上述结果表明NiCl_2可从体内外诱导小鼠肾脏细胞铁死亡。2.自噬参与NiCl_2诱导的TCMK-1细胞铁死亡前期已证实NiCl_2能诱导TCMK-1细胞发生自噬,本试验也发现p62蛋白表达明显降低、LC3-Ⅱ/Ⅰ比值显著升高、透射电镜下观察到自噬溶酶体和自噬小体增多,表明了自噬的发生。为进一步验证自噬在NiCl_2诱导TCMK-1细胞铁死亡中的作用,试验选用自噬促进剂RAPA和自噬抑制剂3-MA来共同处理。自噬促进试验结果显示,与NiCl_2组相比,NiCl_2与RAPA联合处理后铁含量明显升高;MDA含量明显升高、T-SOD活性和GSH含量明显下降;脂质活性氧绿色荧光明显增强;蛋白印迹和qRT-PCR结果显示COX-2表达增加、SLC7A11和GPX4表达减少。然而,自噬抑制试验结果显示,NiCl_2与3-MA联合处理后铁死亡相关指标表现与RAPA共处理结果相反。结果表明自噬参与NiCl_2诱导的TCMK-1细胞铁死亡。3.自噬通过降低铁蛋白表达参与NiCl_2诱导的TCMK-1细胞铁死亡的发生体内外试验结果显示NCOA4和FTH1蛋白和mRNA表达水平在NiCl_2处理组显著下调。体外试验显示,与NiCl_2组相比,在使用RAPA后,NCOA4和FTH1蛋白和mRNA表达下降更加明显,而使用3-MA后NCOA4和FTH1蛋白和mRNA表达量得到升高。这表明自噬可能通过降解铁蛋白参与诱导铁死亡。为进一步验证铁蛋Vorinostat说明书白的作用,选用铁离子螯合剂DFOM进行干预试验,结果显示,与NiCl_2组相比,NiCl_2与DFOM联合组铁含量明显降低;MDA含量显著减少、T-SOD活性和GSH含量明显升高;脂质活性氧绿色荧光明显减弱;蛋白印迹和qRT-PCR结果显示COX-2表达降低、而SLC7A11、GPX4、NCOA4和FTH1表达增加。结果表明自噬可通过降低铁蛋白表达,释放铁离子,从而参与NiCl_2诱导的TCMK-1细胞铁死亡的发生。4.铁死亡是NiCl_2诱导TCMK-1细胞肾毒性的作用机制之一为进一步探讨铁死亡在NiCl_2诱导TCMK-1细胞肾毒性中的作用,试验选用铁死亡抑制剂Fer-1进行干预试验,结果显示,Ni Cl_2与Fer-1联合组铁死亡得到抑制,铁含量明显降低;细胞的氧化应激得到缓解,MDA含量显著减少、T-SOD活性和GSH含量明显升高;脂质活性氧绿色荧光明显减弱;蛋白印迹和qRT-PCR结果显示COX-2蛋白和mRNA表达降低、而SLC7A11和GPX4表达增加。与NiCl_2组相比,NiCl_2与Fer-1联合处理可显著缓解NiCl_2对细胞活性的抑制。结果表明抑制铁死亡可明显减轻NiCl_2诱导的TCMK-1细胞肾毒性。综上所述,NiCl_2可诱导小鼠肾脏细胞铁死亡的发生,且铁死亡是NiCl_2诱导的肾脏毒性的重要机制之一。NiCl_2依赖自噬诱导肾脏细胞铁死亡,自噬通过降低铁蛋白表达,释放铁离子,导致铁超载进而诱导铁死亡的发生。