糖尿病是以高血糖为特征的一种代谢性疾病。糖尿病可能会引起一系列并发症。抗氧化剂能够通过清除体内自由基来减少氧化损伤,从而达到预防糖尿病及其并发症的目的。DPP-Ⅳ(二肽基肽酶genetic overlap4)是人体内参与血糖调节的酶,其抑制剂目前普遍用于临床降血糖治疗。常用的抑制剂有西格列丁、沙格列丁等,但是长期服用会引起一系列的副作用。活性肽具有无毒、温和、易吸此网站收的特点,一些抗氧化肽除了具有抗氧化功能活性,还可通过抑制DPP-Ⅳ的活性来延迟人体对葡萄糖的吸收来达到降血糖的目的。这使得从天然蛋白质中提取食品源DPP-Ⅳ抑制肽和抗氧化肽成为研究热点。脱脂南极磷虾粉是南极磷虾(Euphausia superba)虾油加工的副产物,具有蛋白质含量高,脂肪含量低的特点,是提取生物活性肽的优质原料。因此,本研究以脱脂南极磷虾粉为原料,通过酶解法GSK2118436提取生物活性肽,以原料利用率为指标进行单因素和响应面工艺优化。以ABTS和DPPH自由基清除能力以及DPP-Ⅳ抑制能力为标准,采用超滤和凝胶层析技术进行纯化。最后对活性肽进行结构鉴定,并通过分子对接研究DPP-Ⅳ抑制肽的抑制机理和MPO(髓过氧化物酶)潜在抑制活性。最后进行中试规模制备。以期为脱脂南极磷粉的高值化利用和降血糖、抗氧化药物的开发提供理论依据。具体研究内容如下:1.本文以脱脂南极磷虾粉为原料,原料利用率为优化指标,通过单因素实验和响应面实验对酶解工艺进行优化。得到脱脂南极磷虾粉最适酶解条件为:酶解时间为4h19min,料液比1:7.78,酶添加量为1.66%。在此酶解工艺下原料利用率为80.68%±0.32%,所得水解液冻干粉相对分子量小于3000 Da的组分占比高达98%,DPP-Ⅳ抑制率为80.06±6.6%,DPPH自由基清除率43.50±1.2%,ABTS自由基清除率为34.35±1.3%,具有良好的生物活性。2.通过探究不同酶解时间对酶解液的水解度、DPP-Ⅳ抑制活性、DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和分子量分布的影响,发现随着酶解时间的增加,水解度逐渐上升,并且在4 h时趋于平缓,此时ABTS自由基清除率为34.35±1.3%,DPPH自由基清除率为43.50±1.2%,DPP-Ⅳ抑制活性为78.06±3.6%。酶解时间越长水解液小分子量的占比就越小,肽的疏水性氨基酸含量占总氨基酸含量的44.16%,这是影响生物活性的的重要因素。然后将酶解液进行超滤,得到4个组分,≥10 ku,10 ku>MW≥5 ku,5 ku>MW≥3 ku和<3 ku,其中<3 ku的组分具有较高的降血糖活性和抗氧化活性,DPP-Ⅳ抑制率83.12±0.77%,DPPH自由基清除率55.40±0.45%,ABTS自由基清除率40.25±1.11%。将超滤组分中<3 k Da的组分通过Sephadex G-15层析分离成六个组分(M1、M2、M3、M4、M5和M6),M3组分的活性最高,DPPH自由基清除活性为77.99±1.22%,ABTS自由基清除活性为84.60±0.20%,DPP-Ⅳ抑制活性为57.23%±0.48%(5 mg/m L)。将M3组分通过质谱进行肽序列的分析,共鉴定出128条肽,结合质谱得分,Peptide Ranker得分,i DPPⅣ-SCM得分和抗氧化评分,筛选出具有潜在高抗氧化和降血糖活性的六条肽:WPPLSPFRCPR,NRPIPPWI,IPDWFLNRQ,PFGLYVHHSWF,FLWLKK TPLPL,DTVPWFPR。3.对六种肽进行固相合成后验证其活性,六种肽都具有较好的抗氧化活性,其中四种肽具有较好的DPP-Ⅳ抑制活性:WPPLSPFRCPR,IC_(50)=2.121±0.31 mmol/L;IPDWFLNRQ,IC_(50)=0.6163±0.097 mmol/L;FLWLKKTPLPL,IC_(50)=1.158±0.71mmol/L;DTVPWFPR,IC_(50)=4.923±2.0 mmol/L。分子对接结果表明,这四种肽与DPP-Ⅳ分子对接于活性口袋。这六条肽与MPO(髓过氧化物酶)均表现出较低的对接分数,进一步说明了其作为抗氧化肽的可能。通过使用体外模拟的胃肠消化模型,研究了脱脂南极磷虾粉多肽的活性稳定性。结果表明,经过模拟胃肠消化抗氧化活性降低,DPP-Ⅳ抑制活性略有增加,但仍然保持在相对较高的水平,说明其脱脂南极磷虾粉活性肽在体内也可保持较好的活性。4.通过将脱脂南极磷虾粉活性肽的制备工艺扩大至100L中试规模制备,得到的肽粉分子量<5000 Da的组分占比为98.28%,肽含量为82%,总氮为14.1。肽粉浓度为10mg/ml时,羟基自由基清除率63.11%,总还原力22.51%,超氧阴离子自由基清除率30.86%,α-淀粉酶抑制活性54.21%,α-葡萄糖苷酶抑制活性65.10%,表现出良好的降血糖活性、抗氧化活性,为脱脂南极磷虾粉生物活性肽的产业化生产提供了有益的参考。