众所周知,创伤常常会伴有周围神经损伤,使受损者的感觉和运动功能丧失。对于神经离断伤或短距离缺损,临床上可以通过端端吻合进行修复,但对于长节段周围神经缺损(>3cm),如何有效实现受损神经的结构重建,一直是临床治疗难点。目前,自体或同种异体神cysteine biosynthesis经移植是长节段周围神经缺损的主要治疗方式,但受到供体有限、供体功能丧失、供受体神经直径不匹配的困扰,在临床应用上受到诸多限制。上世纪80年代,出现了第一代人工神经导管,之后又研发出具有不同结构、不同原材料的人工神经导管,取得了一定的临床疗效。然而,目前使用的人工神经导管并不能很好的对神经解剖结构及微环境进行仿生构建,在一定程度上限制了长距离神经缺损的修复效果。近年来,生物打印技术的发展为精密化打印人工神经带来希望。目前,虽然已经建立了针对不同基材(如PCL等)的打印技术,但针对基于胶原材料(细胞外基质的主要成分之一)的精密结构打印技术仍存在诸多问题亟待解决:(1)胶原属于粘弹性生物大分子,其可溶性较差。胶原在力学属性上不属于固体或液体,属于性质复杂的软物质,其机械性能有限,打印过程中容易发生坍塌。(2)目前缺乏适合于胶原的生物打印建模和模拟方法,难以解决胶原高精度、微结构的设计和制GSK J4溶解度造。(3)单独使用胶原一种材料无法实现阵列微管结构的构建。需要在胶原基中同步立体分区打印出其它可溶性生物材料,并通过溶解实现周围神经的阵列微管结构。(4)缺乏面向粘弹性的控制模型和定量评估方法。此外,在以胶原为主要原料进行生物打印过程中,实现生物活性因子的浓度分布精确打印和体外活细胞同步打印也具有挑战性。为此,本研究通过建立如下技术,实现了以胶原为主要原料进行周围神经结构构建及生物活性的同步搭载,具体包括:(1)通过蠕变回复、胶原松弛和变形、溶芯材料支撑性、力学性能测试、多打印头印刷工艺等方法,建立了胶原基阵列微管神经支架的精密化生物打印技术,实现了胶原基阵列微管人工神经的精密化生物打印。(2)设计基于离散控制模型的浓度梯度控制方法,建立“实时可视化”梯度印刷量化控制模型,实现了负载梯度NGF的胶原基阵列微管人工神经的生物打印。通过体内外实验证实其可进一步促进神经轴突定向再生和提升神经损伤的治疗效果。(3)开发交联剂生物印刷技术,通过低粘度溶液实现体外活细胞同步生物打印,实现人工神经的活细胞同步搭载。第一部分胶原基阵列微管神经支架的精密化生物打印及应用背景:胶原是细胞外基质的最主要成分之一,是人工神经构建的理想成分。但受制于胶原机械性能有限、缺乏适合于胶原的生物打印建模和模拟方法等问题,实现胶原基人工神经生物打印尚缺乏成熟的技术体系。目的:建立胶原基阵列微管人工神经的精密化生物打印技术,实现生物打印胶原基阵列微管神经支架,评价其神经修复效果。方法:建立基于蠕变回复试验的胶原材料模型识别方法,通过对打印过程中胶原纤维崩溃行为的模拟和分析,筛选适宜的可溶性芯材。通过分析胶原材料的松弛和变形机制,建立胶原材料模型的识别方法和可溶性芯材的定量评估方法,最终建立阵列微管结构的一次打印成型工艺,实现胶原基微管阵列神经支架的高精度打印。通过体内外实验评价胶原基阵列微管人工神经对神经轴突生长和神经损伤修复的治疗效果。结果:对蠕变回复曲线进行了Burgers四元件模型的最小二乘法参数辨识,确定在1%-6%的浓度范围内,胶原材料的蠕变具有线性特征,最终确定使用5%胶原进行生物打印。通过多喷头打印工艺进行胶原材料与溶芯材料的交替打印,最终成功打印具有阵列微管结构的神经支架,扫描电镜证实该神经支架具有周围神经的结构特征。通过体内外实验发现精密化生物打印的胶原基阵列微管神经支架能促进神经轴突定向生长,并改善15mm大鼠坐骨神经损伤的治疗效果。结论:本研究建立了胶原基材料的生物打印技术,实现了胶原基阵列微管神经支架的精密化生物打印,体内外实验证实其可促进神经再生和神经功能恢复。第二部分负载梯度NGF人工神经的精密化生物打印构建背景:生物活性因子在组织再生中具有重要作用。在前期建立的胶原基人工神经材料打印技术基础上,研发同步负载神经活性因子,进一步提高其神经诱导活性,具有重要意义。目的:建立胶原基阵列微管人工神经同步负载梯度活性因子的生物打印技术,提高人工神经的营养活性,并明确其促神经再生的效果。方法:构建双组分电动挤出打印喷头,设计基于离散控制模型的浓度梯度控制方法,进行活性因子沿阵列微管结构的梯度打印。建立光校准自动浓度梯度检测方法,进行浓度梯度分布的定量表征。通过EDC/NHS交联剂实现NGF在胶原纤维上的固化,将多糖肝素添加到交联体系中,通过异氰酸酯荧光素标记胶原,建立“实时可视化”的梯度打印量化控制模型。最终通过体内外实验评价负载梯度NGF的人工神经对神经生长的作用。结果:建立NGF梯度打印技术,实现了胶原基阵列微管结构和NGF梯度的同步构建。通过“实时可视化”模型,发现NGF可以与胶原纤维直接定位,并可以实现NGF浓度梯度的可视化观测。ELISA检测进一步证实NGF在胶原基人工神经上呈现线性分布。体内外实验发现负载梯度NGF的胶原基人工神经能进一步促进神经轴突的定向生长,并改善大鼠15mm坐骨神经损伤后的修复效果。结论:本研究成功建立胶原基阵列微管结构和NGF梯度的同步生物打印技术,可进一步提升人工神经的生物活性,改善神经损伤修复效果。第三部分负载活细胞人工神经的精密化生物打印构建背景:周围神经损伤后的修复过程需要多种细胞的动态调控与积极参与。在胶原基阵列微管人工神经的基础上,如能实现一体化活细胞同步搭载,也将有利于神经损伤修复效果的提升,是胶原基生物打印技术的另一个需要解决的问题。目的:建立胶原基阵列微管结构与活细胞同步打印技术,构建搭载活细胞的胶原基人工神经,并明确其治疗效果。方法:提取原代骨髓间充质干细胞,体外诱导点击此处其成为类雪旺细胞(Bd SCs)。通过交联凝胶化,进行胶原基阵列微管人工神经与活细胞同步打印。通过体内外实验评价负载Bd SCs的胶原基人工神经的治疗效果。结果:制备活细胞生物材料悬浮液,将活细胞和胶原均匀混合形成生物材料,明确低粘度胶原水凝胶更适合细胞生长。构建了适合活细胞生物打印的生物打印识别参数。使用凝血酶作为交联剂,提高活细胞同步打印的塑形性。通过生物打印机中的高压灭菌喷头进行微挤出打印工艺,制备了活细胞同步生物打印的胶原基人工神经。通过体内外实验证实同步生物打印Bd SCs的胶原基人工神经能促进神经再生,并改善大鼠15mm坐骨神经损伤后的修复效果。结论:本研究成功建立胶原基阵列微管结构和活细胞同步生物打印技术,可进一步促进神经轴突的生长潜能,改善神经损伤修复效果。