随着人们生活水平的提高,宠物的饲养水平也在不断提高。高脂饲料(HFD,缩写全文见附录,下同)的过量饲喂会使动物机体更加容易患上肥胖症,并发生胰岛素抵抗和糖尿病,从而给动物的VX-765 IC50健康带来巨大的风险。胰岛素抵抗是一种慢性综合征,表现为机体的一些组织细胞对胰岛素的敏感性降低,从而继发高血糖和高胰岛素血症。胰岛素抵抗的发生是II型糖尿病(T2DM)的一个典型先兆。然而,在高脂饲料诱导胰岛素抵抗发生的过程中,机体的骨骼肌和心肌在能量学和线粒体动力学等方面是如何变化的,目前还未完全阐明。为此,本研究以C57BL6小鼠为实验对象,通过12周的高脂饲料成功诱导胰岛素抵抗模型。在饲喂高脂饲料第6、8、10和12周的第一天,通过观察各组小鼠的临床表现、体重、体型和整体状态,来分析他们的胰岛素抵抗情况。在此基础上检测各组小鼠骨骼肌和心肌的组织病理学变化和相关基因在蛋白水平的表达,来分析在胰岛素抵抗进程中,小鼠的骨骼肌和心肌在线粒体能量代谢方面的变化情况,希望为日后进一步开展深入的研究提供一定的参考。本实验以C57BL6小鼠为实验动物,设置2组,分别为对照组(Con组)和高脂饲料组(HFD组)。分别在实验进行的第6、8、10、12周的第一天观察两组小鼠的整体状态、测量体重,同时进行行为学的分析,采用抓握反射实验进行小鼠抓握能力和牵引能力的检测,应用旷场实验测量各组小鼠的运动总路程和跨格次数;然后使用血糖试纸和胰岛素试剂盒检测各组小鼠的空腹血糖、空腹胰岛素指标,利用葡萄糖耐受实验和计算胰岛素抵抗指数,评价各组小鼠的胰岛素抵抗情况;检测两组小鼠血清心肌酶含量;然后拍照、记录各组小鼠骨骼肌和心肌的大体解剖情况;应用试剂盒检测各组小鼠的骨骼肌和心肌呼吸链复合物Ⅰ(COX-Ⅰ)、呼吸链复合物Ⅴ(COX-Ⅴ)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)的含量和磷酸果糖激酶(PFK)、乳酸脱氢酶(LDH)的活性;进行骨骼肌、心肌组织HE染色、PAS染色、Masson染色,观察各组小鼠骨骼肌和心肌在病理组织学上的变化;用透射电镜观察骨骼肌和心肌组织线粒体损伤程度及肌纤维的变化;采用蛋白质免疫印迹法和免疫荧光法检测骨骼肌和心肌中相关蛋白的表达。实验结果表明,通过连续饲喂12周60%高脂饲料的方法,成功诱导了C57BL6小鼠胰岛素抵抗。与对照组相比,实验组小鼠精神逐渐萎靡、反应逐渐迟钝,毛发由平伏有光泽逐渐变为毛竖无光泽,动作越发迟缓,逐渐趋于弓背、蜷体、喜卧、不愿运动、行动迟缓,体重增加幅度大、Lee’s指数显著增加;胰岛素抵抗指数显著上升、葡萄糖不耐受;骨骼肌重量显著增加,但在12周左右骨骼肌重量增加不显著,逐渐发生肌细胞排列松散、肌纤维萎缩及边缘角化等病理变化,骨骼肌细胞逐渐出现脂质沉积、线粒体损伤和肌纤维的萎缩,骨骼肌细胞中的糖原含量逐渐减少;实验组小鼠心脏明显有沿横轴生长的趋势,心肌逐渐发展为肌丝排列稀疏、肌丝溶解,最后发展为肌丝纤维化;逐渐出现细胞核皱缩、心肌内脂褐素增加、心肌线粒体肿胀、嵴断裂,最后发展为心肌的纤维化,此时,血液中肌酸激酶含量逐渐升高,心肌中TGF-β和P-Smad2/3蛋白表达逐渐升高。通过检测组织内胰岛素信号通路的变化结果可见,饲喂高脂饲料小鼠骨骼肌及心肌内PI3K的表达显著低于对照组,且实验模型组随着饲喂周数的增加PI3K表达有不断下降的趋势;实验组FOXO1磷酸化程度明显低于对照组,且实验组FOXO1位于细胞核内;G6Pase蛋白表达水平显著高于对照组,饲喂高脂饲料10周和12周小鼠骨骼肌和心肌中G6Pase表达无差异;实验组GLUT4与细胞膜的融合程度低于对照组;从第8周开始,GLUT4的表human gut microbiome达水平和与细胞膜的融合程度不再降低;磷酸化形式GSK-3β的表达水平显著低于对照组,未磷酸化GSK-3β蛋白表达水平却高于对照组;实验组小鼠骨骼肌和心肌的LDH和PFK活性逐渐升高、糖酵解途径逐渐增强。组织内能量代谢相关指标检测结果显示:实验组小鼠的骨骼肌和心肌内,ATP、COX-Ⅰ和COX-Ⅴ的含量显著低于对照组,且随着饲喂时间的延长,含量逐渐下降;实验组小鼠的骨骼肌中AMPK、P-AMPK、PGC-1α和SIRT1蛋白的表达显著低于对照组,并且随着饲喂高脂饲料时间的延长,呈现出下降的趋势;实验组小鼠骨骼肌和心肌中的Mfn2、Opa1蛋白均显著下降、Drp1蛋白均显著升高,且呈现出明显的时间依赖性下降和升高;实验组小鼠骨PLX3397半抑制浓度骼肌和心肌的PINK1蛋白的表达均无显著变化,但Parkin蛋白的表达均呈现出逐渐下降的趋势。结果表明:连续饲喂12周60%高脂饲料,成功诱导C57BL6小鼠发生胰岛素抵抗,发生胰岛素抵抗后,骨骼肌和心肌逐渐发生病理性损伤及功能的减退;胰岛素信号通路被抑制,导致葡萄糖转运下降、糖异生增强;另外,线粒体的功能发生障碍,表现为ATP合成能力下降、线粒体生物发生减弱、线粒体融合降低、分裂升高、自噬下降,此外尤其发现在胰岛素抵抗的发展过程中,C57BL6小鼠的骨骼肌和心肌主要依赖于糖酵解途径供能,在胰岛素抵抗的初期,C57BL6小鼠骨骼肌的糖原合成途径即被抑制。本实验研究明确了小鼠骨骼肌和心机在胰岛素抵抗的发生进程中,细胞能量来源的转变、组织内线粒体动力学的变化以及组织内线粒体功能的变化情况,从而为进一步的研究提供一定的参考。