目的:化疗耐药很大程Belnacasan采购度上限制了晚期胃癌患者治疗的有效性,是导致癌症复发和不良预后的重要原因。肿瘤微环境中的基质细胞尤其是肿瘤相关间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC),在肿瘤进展及免疫逃逸中发挥重要作用。胃癌来源间充质干细胞(Gastric cancer derived mesenchymal stem cell,GCMSC)能够通过上调胃癌细胞程序性死亡配体-1(Programmed death ligand 1,PD-L1)促进肿瘤增殖、转移和免疫逃逸等,然而GCMSC对化疗耐药的影响及其具体机制尚未明确。本研究旨在探究GCMSC介导的PD-L1在胃癌化疗耐药中的作用及其机制,为提高胃癌化疗有效率提供新的思路。方法:获取新鲜胃癌组织后采用贴壁培养法分离出GCMSC并进行体外培养和扩增,流式细胞术检测GCMSC表面标志,联合成脂成骨诱导实验对GCMSC进行鉴定。CCK-8法检测胃癌细胞HGC-27和SGC-7901对化疗药物顺铂(Cisplatin,DDP)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)和紫杉醇(Paclitaxel,PTX)的半数抑制浓度(Half maximal inhibitory concentrations,IC50)。通过PD-L1中和抗体或慢病毒转染阻断或上调胃癌细胞PD-L1表达、通过si RNA转染干扰胃癌细胞CCCTC结合因子(CCCTC-binding factor,CTCF)和Smad家族成员4(Decapentaplegic homolog 4,Smad4)、用17-AAG抑制胃癌细胞热休克蛋白90(Heat shock protein 90,HSP90)的活性、B02抑制胃癌细胞DNA修复相关蛋白Rad51表达。收集GCMSC条件培养基(GCMSC conditioned medium,GCMSC-CM)与胃癌细胞共培养,分别用CCK-8法、Annexin V/PI双染法、Western blot、q RT-PCR和细胞免疫荧光法检测不同化疗药作用下的胃癌细胞存活率、细胞凋亡率、PD-L1等相关蛋白和m RNA的表达。通过细胞免疫荧光染色和细胞核质蛋白分离法观察PD-L1等蛋白的细胞内定位。克隆形成实验检测胃癌细胞克隆形成率。构建BALB/c裸鼠胃癌异种移植皮下瘤模型,定期瘤周注射GCMSC-CM和腹腔给药。Whole Genome Sequencing测量肿瘤大小和质量,绘制肿瘤生长曲线,免疫组织化学法和Western blot检测肿瘤组织中相关蛋白表达。收集临床接受化疗后手术的胃癌组织标本制成石蜡切片,免疫组织化学染色检测PD-L1等相关分子表达,进行组化评分和相关性分析。结果:(1)成功分离出GCMSC并进行鉴定。与GCMSC-CM共培养后的胃癌细胞经化疗药DDP、5-FU和PTX处理时,细胞存活率升高、凋亡率减少、克隆形成能力增强,同时伴随PD-L1、多药耐药相关蛋白MDR1、LRP和肿瘤干性相关指标CD44、OCT4的表达增多,表明GCMSC-CM对化疗耐药的促进作用可能与PD-L1有关。(2)过表达PD-L1的胃癌细胞经5-FU和PTX处理后细胞存活率升高、凋亡减少、克隆形成能力增强,MDR1、CD44和OCT4蛋白表达与PD-L1同步升高,与GCMSC-CM组现象一致。敲低胃癌细胞PD-L1表达则逆转了由GCMSC-CM导致的耐药性增强,促使胃癌细胞对DDP等化疗药的敏感性升高。PD-L1中和抗体作用于胃癌细胞后与敲低PD-L1的结果显示一致。构建BALB/c裸鼠胃癌移植瘤模型,体内实验结果显示GCMSC-CM减弱5-FU的治疗效果,敲低胃癌细胞PD-L1表达后可增强对5-FU的敏感性。体内外结果均显示GCMSC-CM通过调控胃癌细胞PD-L1表达促进化疗耐药。(3)抑制胃癌细胞CTCF表达后降低了PD-L1、CD44、MDR1等蛋白表达同时逆转GCMSC-CM诱导的干性和耐药性增强。提示GCMSC-CM可能通过调控CTCF-PD-L1促进胃癌干性及耐药。(4)免疫荧光结果显示GCMSC-CM减少胃癌细胞中由DDP引起的DNA损伤。通过q RT-PCR筛选出与GCMSC-DorsomorphinCM密切相关的DNA修复相关因子Rad51。结果表明GCMSC-CM在DDP存在的情况下上调胃癌细胞中Rad51、Mre11和NBS1的表达,同时维持Rad51的稳定性。Rad51抑制剂B02的使用进一步验证了GCMSC-CM通过上调胃癌细胞Rad51表达保护胃癌细胞免受DDP诱导的凋亡。(5)GCMSC-CM和DDP共同作用下,胃癌细胞PD-L1在核内的表达明显升高。Co-IP实验证实了PD-L1与Rad51的相互作用。Western blot、q RTPCR、免疫荧光均显示敲低PD-L1抑制了GCMSC-CM介导的Rad51高表达。Smad4与Rad51相互作用且干扰Smad4表达后Rad51表达降低。胃癌细胞中HSP90被GCMSC-CM上调,用17-AAG抑制HSP90活性后逆转了GCMSCCM对PD-L1和Rad51的上调,同时DDP诱导的DNA损伤增多。表明GCMSC-CM可能通过调控HSP90/PD-L1影响胃癌细胞Rad51的表达从而促进化疗耐药。此外,BALB/c裸鼠胃癌模型的构建也验证了这一点。(6)临床胃癌标本的免疫组化结果显示PD-L1、CTCF、Rad51、HSP90均与不良预后相关。并且,CTCF、Rad51和HSP90均与PD-L1呈正相关关系。结论:GCMSC-CM调控胃癌细胞中CTCF-PD-L1表达增强肿瘤干性并通过上调PD-L1增强DNA同源重组修复关键蛋白Rad51的表达促进DNA修复能力,抵抗化疗药引起的DNA损伤,从而诱导胃癌细胞在肿瘤微环境中对5-FU、PTX和DDP的耐药性增强。阻断PD-L1和HSP90联合化疗药能够改善对胃癌的治疗效果。本研究为胃癌患者克服化疗耐药,增强化疗有效性提供了一个新的思路。