研究背景:肠道运动是指食物通过消化道的运动定向推进,这是食物中营养成分摄入与废物排出所必需的。一旦机体出现肠道运动障碍,会直接导致营养吸收不良,并出现诸如如腹泻、便秘、腹痛等消化道症状,对身体健康和生活质量造成直接影响。临床上,肠道运动障碍与肠易激综合征、炎症性肠病等消化道常见疾病有关,同时也可能在包括糖尿病、帕金森病、自闭症等肠外疾病引起的消化道功能障碍中发挥着重要作用。胃肠动力由肠道神经系统(ENS)协调,主要由粘膜下神经丛和肠肌间神经丛的蠕动反射控制肌3-Methyladenine化学结构肉收缩和松弛完成,位于肠壁中的肠道神经元组成反射回路,直接或间接地感受管腔拉伸,以激活调节肌源性收缩活动并驱动管腔内容物的定向推进。这种神经源性蠕动现象一直是ENS研究最多的呈现方式,但许多基本问题仍未得到解答。已知ENS主要组成细胞之一的肠胶质细胞(Enteric Glial Cell,EGC)能调节肠道运动,并维持肠道稳态;肠道损伤可诱导EGC反应性胶质表型增多,也被称之为“神经胶质增生症(gliosis)”,但在调节肠道运动中的分子机制仍缺乏充分了解。我们使用RT-qPCR、Western blot、CCK-8、流式细胞术、免疫荧光、单细胞水平钙成像、慢病毒转染和体内体外药理学方法的组合来研究肠胶质细胞中TRPV4在肠胶质增生以及肠道运动中的作用。我们研究发现:(1)在大鼠EGC细胞系CRL-2690中检测到TRPV4 mRNA和蛋白表达;(2)体外激活EGC中TRPV4,促进胞内Ca~(2+)浓度上升,诱导ATP与炎症因子释放以及细胞增殖;(3)体内激活TRPV4降低小鼠的肠道动力,并诱导EGC反应性胶质增生;(4)机制上,TRPV4可能通过介导上游调控因子CaSR以及神经递质引起的EGC外钙内流,参与反应性胶质增生。因此,在肠道炎症期间,阻断EGC TRPV4引起的钙信号可能是治疗免疫驱动型肠动力障碍的新疗法,为利用TRPV4和EGC治疗肠道动力障碍开辟了可能性。第一部分TRPV4在肠胶质细胞系中的表达并介导Ca~(2+)信号目的:检测TRPV4在CRL-2690细胞中的表达水平,并探索TRPV4在肠胶质细胞中引起的钙信号。方法:收集大鼠肠胶质细胞系CRL-2690、大鼠肠上皮细胞系IEC6和人胚肾细胞系HEK293T样本,采用Western blot和RT-qPCR检测TRPV4在肠胶质细胞、IEC6、人胚肾细胞系HEK293T中蛋白、mRNA的表达;通过免疫荧光检测TRPV4与GFAP在肠胶质细胞中的共定位;将CRL-2690细胞依次分为对照组、GSK组、GSK+HC组,单细胞荧光钙离子浓度测定CRL-2690细胞荧光强度变化;将CRL-2690细胞依次分为GSK组与GSK+HC组,低渗组与低渗+HC组,单细胞荧光钙离子浓度测定TRPV4的激动剂GSK1016790A和低渗透压刺激在肠胶质细胞中引起的钙信号变化。结果:Western blot和RT-qPCR实验发现TRPV4在肠胶质细胞、上皮细胞系IEC6中均有表达,在人胚肾细胞系HEK293T中无表达;免疫荧光结果显示TRPV4在CRL-2690细胞中有表达,定位于细胞质与细胞膜;单细胞荧光钙离子浓度测定结果表明TRPV4激动剂和低渗刺激可引起肠胶质细胞内Ca~(2+)信号增强,这种反应能被HC067047所抑制。结论:TRPV4在EGC中有表达,并介导外钙内流的作用。第二部分体外激活EGC中TRPV4,诱导ATP与炎症因子释放以及细胞增殖;体内激活TRPV4诱导肠胶质增生抑制小鼠肠道转运目的:研究TRPV4对EGC增殖、炎症因子分泌以及小鼠肠道转运的影响。方法:将CRL-2690细胞分为CON组、GSK组、GSK+HC组、HC组,CCK-8实验、流式细胞术研究EGC的增殖及周期的变化;慢病毒转染敲降TRPV4的shRNA后检测TRPV4对CRL-2690细胞的增殖及周期的影响;单细胞荧光钙离子浓度成像探讨sh TRPV4的钙信号变化;利用RT-qPCR检测CRL-2690细胞炎症因子的表达;使用荧光素-荧光素酶法检测CRL-2690细胞ATP的释放;建立小鼠肠道转运模型研究TRPV4对肠道转运的影响。结果:1、CCK-8实验结果表明GSK激活TRPV4促进EGC细胞增殖,该作用可被HC067047抑制。2、流式细胞术分析显示,激活TRPV4导致G1期细胞数量减少,而S期细胞增多。3、基因水平敲降TRPV4后抑制EGC细胞的增殖,进一步说明TRPV4可以促进EGC细胞的增殖。4、基因水平敲降TRPV4,肠胶质细胞内Ca~(2+)信号对GSK和低渗透压刺激composite hepatic events的反应降低。5、RT-qPCR实验结果表明TRPV4通道活化后,反应性增生标记物GFAP升高,炎症因子IL-1β、IL-6表达增多,抗炎因子IL-10表达下降,该作用可被HC067047抑制,表明TRPV4可能是EGC参与肠道炎症反应的重要机制。6、荧光素-荧光素酶实验发现激活TRPV4通道导致EGC释放ATP,而HC067047K可抑制此作用。7、在小鼠肠道转运实验中,发现体内激活TRPV4抑制了小鼠肠道转运,导致肠道转运时间延长、体内粪Empagliflozin使用方法便增多、排出粪便减少、排出粪便的含水量减少;使用FC后,所有指标均有所回复,单独使用FC不影响肠道转运,说明EGC中的TRPV4参与肠道转运的功能。8、在体内激活TRPV4可诱导肠胶质增生。结论:在体外激活TRPV4促进肠胶质细胞增殖、炎症因子表达与ATP释放,最终促进炎症反应;在体内激活TRPV4可诱导肠胶质增生并抑制肠道运动。表明EGC参与了TRPV4介导的肠道运动障碍,为临床肠道炎症性疾病及肠道运动障碍防治提供了潜在策略。第三部分TRPV4介导CaSR、UTP、ATP引起的外钙内流目的:研究TRPV4对CRL-2690细胞内Ca~(2+)信号的上游调控机制。方法:将分别使用钙敏感受体CaSR的激动剂或神经递质UTP或ATP处理CRL-2690细胞,采用Fura-2荧光探针和单细胞荧光Ca~(2+)成像技术检测药物对CRL-2690细胞和TRPV4稳定敲降细胞内Ca~(2+)信号的影响;CCK8实验检测细胞增殖的影响。结果:1、在EGC细胞中,经典的TRPV4上游调控蛋白CaSR亦能通过TRPV4调控细胞钙信号。2、在EGC细胞中TRPV4通道参与了CaSR激活后促进的EGC细胞增殖。3、在EGC细胞中TRPV4通过SOCE机制参与神经递质UTP和ATP引起的外钙内流与细胞增殖。结论:在EGC细胞中,TRPV4介导上游调控蛋白CaSR与神经递质引起的外钙内流以及细胞增殖。上游神经信号作用于EGC,可能通过细胞表面受体,引起TRPV4离子通道开放,从而促进胞外钙离子内流,诱导EGC细胞增生可以为在体内激动TRPV4导致肠道运动障碍提供理论依据。