肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的原发性肝癌,是癌症死亡的第三大原因,五年生存率仅18%。代谢性脂肪性肝病(metabolic fatty liver disease,MAFLD)、乙/丙型肝炎病毒(hepatitis B/C viruses,HBV or HCV)、黄曲霉素B1以及过量酒精摄入均是肝细胞癌发病的危险因素。肝细胞癌的发生发展是一个复杂多步骤的过程,且越来越多研究发现肝细胞死亡与肝细胞癌的发生发展过程存在密不可分的关系。在健康的肝脏中几乎没有肝细胞死亡,当病毒、代谢性因素、毒素或免疫损伤时,肝脏中将出现大量的肝细胞死亡,进一步诱发肝脏慢性炎症及其肝细胞代偿性增殖,最终发展为肝细胞癌。因此针对细胞死亡、肝损伤以及肝细胞癌发生分子调控机制的研究具有重要的科学意义。IRG1(immunoresponsive gene 1,IRG1)又名Acod1,其编码的顺乌头酸脱羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase,CAD)在哺乳动物体内定位于线粒体内PF-02341066体内,在三羧酸循环过程中催化顺乌头酸形成衣康酸。既往研究表明巨噬细胞中的IRG1在抑制炎症过程中具有重要作用,研究发现损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern,DAMPs)或病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMPs)可引起巨噬细胞中的IRG1基因表达显著上调,从而导致线粒体内生成衣康酸产生增多,衣康酸通过对多种蛋白的半胱氨酸残基进行烷基化(alkylation)修饰或通过抑制琥珀酸脱氢酶(succinodehydrogenase,SDH)从而发挥抑制炎症的作用。此外,本团队的一项研究还发现脓毒血症时巨噬细胞中表达上调的IRG1可通过促进ROS产生及A20表达进而促进机体内毒素耐受。近年来,有学者探讨了IRG1及其代谢产物衣康酸在肝脏疾病中的作用。一项研究研究发现在刀豆蛋白A(concanavalin A)诱导的急性肝损伤中,野生型小鼠肝脏巨噬细胞内IRG1/衣康酸表达升高,可通过减少肝细胞凋亡,同时抑制巨噬细胞中NRF2/HO-1及NF-κB信号通路活化进而减轻巨噬细胞引起的炎症反应,最终减轻con A诱导的急性肝损伤。另一项研究发现,高脂饮食(high fat diet,HFD)诱导小鼠的肝脏巨噬细胞中的mi R-144显著上调,从而抑制IRG1表达并减少其代谢产物衣康酸的产生,进一步增强SDH和延胡索酸水化酶(fumarate hydratase,FH)的活性,并导致其底物琥珀酸和延胡索酸减少,进而减少NRF2信号通路抗氧化系统活化,促进肝脏炎症。还有研究进一步探讨了肝细胞IRG1在肝脏缺血再灌注损伤中的作用,该研究运用IRG1全身性敲除小鼠及其骨髓嵌合体小鼠模型表明肝细胞内的IRG1及其代谢产物衣康酸可通过激活NRF2,从而上调肝细胞内抗氧化应激相关基因的表达,进而抵抗肝脏缺血再灌注所致的急性肝损伤。然而,肝细胞IRG1在肝细胞死亡、肝损伤以及肝癌发生疾病进展过程中的作用及其潜在机制目前尚不清楚,且既往开展的研究大多基于IRG1全身性敲除小鼠。因此,本研究拟利用IRG1肝细胞特异性敲除小鼠探究肝细胞IRG1在肝细胞癌发生发展中的调控作用和分子机制。为了探索肝细胞IRG1在肝细胞死亡、肝损伤以及肝细胞癌发生中的作用,我们首先给予C57BL/6小鼠进行DEN 100mg/kg腹腔注射,q PCR和western blot结果显示DEN诱导48h后肝脏组织中IRG1的表达显著上调。进一步在APAP(400mg/kg)诱导的C57BL/6小鼠急性肝损伤模型中也得到了相同的结果,即APAP诱导24h后肝脏组织中IRG1的m RNA和蛋白表达水平均显著上调。因此以上结果提示肝细胞IRG1可能在肝细胞癌发生中存在潜在的调控作用。随即,我们构建了IRG1肝细胞条件性敲除小鼠(IRG1~(f/f)和IRG1~(hep-/-)),通过分离小鼠肝脏原代肝细胞验证了IRG1肝细胞敲除的有效性。进一步对IRG1~(f/f)和IRG1~(hep-/-)小鼠进行DEN(25mg/kg腹腔注射,诱导8个月)和STAM(链脲霉素200μg皮下注射联合高脂饮食诱导5个月)诱导的肝细胞癌发生模型造模,结果显示肝细胞IRG1敲除组的小鼠的肿瘤发生率、肿瘤个数以及肿瘤最大直径均显著低于对照组小鼠。因此,以上结果说明肝细胞IRG1促进肝细胞癌发生。接下来,我们通过DEN诱导的IRG1肝细胞条件性敲除小鼠的急性肝损伤模型发现,DEN诱导48h后IRG1~(f/f)组小鼠的血清肝酶(ALT和AST)水平显著高于IRG1~(hep-/-)组小鼠,肝脏组织HE染色、TUNEL免疫荧光染色以及cleaved caspase-3免疫组化染色和western blot实验结果都提示IRG1~(f/f)组小鼠的肝损伤较IRG1~(hep-/-)组小鼠更严重。进一步在APAP诱导的IRG1肝细胞条件性敲除小鼠的急性肝损伤模型中,以及APAP诱导的肝细胞损伤的体外模型(BNL CL.2和HHL-5细胞株)中也得到了相同的结论。因此,以上结果说明,肝细胞IRG1通过促进肝细胞损伤从而促进肝细胞癌发生。进一步我们对肝细胞IRG1促进肝损伤和肝细胞癌发生的具体机制进行了探索。衣康酸为IRG1编码的代谢产物,我们首先探究了肝细胞IRG1促进肝细胞损伤以及肝细胞癌发生是否依赖于其代谢产物衣康酸。我们给予C57BL/6小鼠进行橄榄油+DEN(对照组)和4-辛基衣康酸(4-OI)+DEN(4-OI组)腹腔注射,在刺激48h后检测肝损伤的相关指标,结果显示对照组小鼠和4-OI组小鼠的血清肝酶水平相当,肝脏组织HE染色、TUNEL免疫荧光染色以及cleaved capase-3免疫组化染色以及wester blot结果也显示两组小鼠肝损伤程度相当。进一步给予C57BL/6小鼠进行橄榄油+APAP和4-OI+APAP腹腔注射,在刺激24h后检测肝损伤的相关指标,也得到了同样的结果。因此以上结果就说明,肝细胞IRG1促进肝细胞损伤不依赖于其代谢产物衣康酸。接下来,我们在DEN和APAP诱导的肝细胞条件性敲除小鼠的肝脏组织中对肝细胞IRG1促进肝细胞凋亡的具体机制进行了探讨。众所周知,细胞凋亡信号通路可分为外源性凋亡信号通路和内源性凋亡信号通路。外源性凋亡信号通路是指死亡受体的配体与膜表面的死亡受体相结合,从而活化胞内的caspase 8,进而导致细胞凋亡的一种细胞死亡方式。内源性凋亡信号通路则是由损伤等因素,导致BCL-2家族分子中的抗凋亡蛋白与促凋亡蛋白间相互作用,进而促进凋亡效应蛋白(Bax或Bak)由胞浆转位至线粒体,使得线粒体外膜通透性增加,线粒体内的细胞色素c释放至胞浆,进而活化下游的caspase导致细胞凋亡的一种细胞死亡方式。因此,我们通过western blot实验检测了DEN和APAP诱导的IRG1肝细胞条件性敲除小鼠的肝脏组织中caspase 8的剪切活化情况,实验结果显示在DEN和APAP诱导的IRG1肝细胞条件性敲除小鼠的肝脏组织中caspase 8没有发生剪切活化。在APAP刺激的BNL CL.2和HHL-5细胞株的体外肝细胞凋亡实验中也得到了相同的结果。说明肝细胞IRG1促进肝细胞凋亡不依赖于外源性凋亡信号通路。进一步,我们通过免疫荧光共聚焦实验技术发现肝细胞中的IRG1与线粒体标志物Tomm-20存在共定位,因此推测IRG1可能通过促进内源性凋亡信号通路活化从而加重肝损伤。我们通过分离胞浆线粒体蛋白的实验发现,在DEN和APAP诱导的急性肝损伤模型中,DEN和APAP可促进Bax由胞浆向线粒体转位,增加线粒体外膜通透性,进而促使线粒体内的细胞色素c释放至胞浆。而在肝细胞中敲除IRG1后,以上效应一定程度上减弱。在体外细胞株中过表达IRG1质粒则发现,IRG1可促进Bax由胞浆向线粒体转位以及细胞色素c由线粒体向胞浆的释放。因此,以上结果说明肝细胞IRG1可通过促进Bax线粒体转位以及细胞色素c的释放从而活化内源性凋亡信号通路并促进肝细胞凋亡。最后,我们深入探索了肝点击此处细胞IRG1促进肝细胞内源性凋亡信号通路活化的具体机制,利用免疫共沉淀-质谱联用技术发现IRG1可与抗凋亡蛋白Mcl-1相互作用。既往研究显示,抗凋亡蛋白Mcl-1可与促凋亡蛋白Bim相互作用,进而抑制Bim对Bax的激活,从而抑制细胞发生内源性凋亡。因此,我们进一步在DEN和APAP诱导的IRG1肝细胞条件性敲除小鼠的肝脏组织中通过内源性免疫共沉淀技术,发现肝细胞中的IRG1可抑制Mcl-1与Bim的结合。在体外肝细胞株中过表达IRG1质粒也得到了相同的结果。因此以上结果就说明,肝细胞中的IRG1可通过与Mcl-1相互作用,使得Bim被释放并促进细胞内源性凋亡。此外,我们分别构建了IRG1、Mcl-1和Bim的截断体真核细胞表达质粒,通过soluble programmed cell death ligand 2外源性免疫共沉淀技术发现,IRG1通过helical结构域阻碍了Mcl-1 BH结构域与Bim BH3结构域的结合,解除了凋亡过程中Mcl-1对Bim的抑制作用,从而使得Bim释放发挥其促内源性凋亡的作用。综上所述,本研究发现肝细胞中的IRG1可通过与抗凋亡蛋白Mcl-1相互作用,使得Bim被释放,Bim通过促进Bax由胞浆转位至线粒体外膜,线粒体外膜通透性增加促使细胞色素c从线粒体释放至胞浆进而剪切活化下游的caspase-3,促进肝细胞发生内源性凋亡,反复大量出现的肝细胞凋亡,最终促进肝细胞癌的发生。本研究首次揭示了肝细胞IRG1在肝细胞癌发生中的作用及其具体机制,为肝细胞癌的干预提供了新的思路和潜在靶点。