围产期奶牛泌乳初期由于干物质摄入不足,泌乳需求增加,导致能量负平衡,大量非酯化脂肪酸通过血液循环进入肝脏。经过不完全氧化和再酯化后,在脂酰辅酶A合成酶的作用下形成大量的游离脂肪酸(FFA),大量FFA进入肝脏后酯化形成甘油三酯(TG),从而形成脂肪肝。Orai1是SOCE在细胞膜上的孔蛋白,本团队前期研究发现在犊牛肝细胞中Orai1调控高FFA引起的内质网应激与脂肪从头合成通路,缓解肝脂沉积。绿原酸(CGA)主要存在于中药金银花、山楂、杜仲、菊花和咖啡中。研究表明,CGA作为清除自由基的物质,具有抗氧化和抗炎作用。然而,CGA对奶牛脂肪肝的保护机制尚未得到充分的研究。因此,本研究旨在明确CGA如何调控围产期奶牛免受脂肪肝的侵袭,为中草药的研究开发提供了理论依据,也为治疗奶牛脂肪肝疾病药物的开发奠定了基础。本研究利用高FFA处理原代犊牛肝细胞构建肝脂沉积模型。我们首先通过测定犊牛肝细胞中的ROS水平来筛选CGA刺激的最佳浓度。用1.2 m M FFA处理犊牛肝细胞12小时,再分别加入不同浓度(10μg/m L、20μg/m L、30μg/m L)CGA,流式细胞分析仪检测ROS含量。结果发现CGA浓度在20μg/m L时治疗效果最好,这也说明CGA具有良好的抗氧化性。为了研究CGA对高FFA引起犊牛肝细胞内质网应激、线粒体自噬以及脂合成方面的作用,本研究首先将分离的原代犊牛肝细胞经1.2 m M FFA处理12小时,然后在培养基加入20μg/m L CGA12小时,检测PERK、IRE1、GRP78、ATF6、CHOP、IKK、IKB、NF-κB p65、ORAI1蛋白水平。结果表明,FFA会使ORAI1表达水平上调,进而导致内质网应激的产生。而CGA减轻了高FFA诱导的内质网应激,降低了NF-κB p65和ORAI1蛋白表达水平,表明CGA通过介导NF-κB/ORAI1来抑制由高FFANirogacestat体内实验剂量引起的内质网应激。为了研究CGA对脂肪肝奶牛肝细胞线粒体自噬与脂沉积的影响,用1.2 m M FFA处理原代犊牛肝细胞12小时后添加20μg/m LCGA处理12小时,检测线粒体损伤相关分子DRP1、MFN2、VDAC1、Cyp D、FIS1,线粒体自噬指标P62、Parkin、LC3,脂合成相关指标SREBP与FAS的蛋白表达情况以及脂滴形态。结果表明与对照组相比在高FFA作用下,线粒体分裂蛋白FIS1,线粒体自噬指标P62、Parkin、LC3,以及脂合成指标FAS、SREBP的蛋白表达情况和脂滴形态均有升高;反之添加CGA处理后,与FFA相比线粒体分裂、线粒体自噬以及脂合成指标均有下调趋势。这Influenza infection说明CGA可以有效地缓解高FFA下犊牛肝细胞线粒体自噬与脂沉积。为了研究CGA是否通过降低内质网应激缓解高FFA引起犊牛肝细胞线粒体自噬与脂沉积,在1.2 m M FFA处理12小时后再加入内质网应激激活剂TG作用6小时,检测ORAI1、内质网应激指Baf-A1价格标PERK、IRE1、GRP78、ATF6、CHOP,线粒体损伤相关分子DRP1、MFN2、VDAC1、Cyp D、FIS1,线粒体自噬指标P62、Parkin、LC3,以及脂合成指标FAS、SREBP和脂滴形态的变化。结果表明,与对照组相比TG会使脂滴数量增加,使内质网应激、线粒体分裂、线粒体自噬以及脂合成指标的蛋白表达量上升,相反添加CGA后,与FFA组相比这些指标均得到缓解。这说明CGA是通过介导内质网应激水平的下调来减轻线粒体自噬和脂合成。综上所述,CGA是通过介导NF-κB/ORAI1抑制由高FFA引起的内质网应激从而缓解线粒体自噬和脂沉积。