目的:明确小鼠腹腔巨噬细胞膜上是否存在膜维生素D受体(membrane VDR,mVDR)以及mVDR的分布情况,阐明青蒿琥酯(artesunate,AS)对脂多糖/内毒素(lipopolysaccharide/endotoxin,LPS)耐受巨噬细胞mVDR分布的影响,为阐明青蒿琥酯逆转LPS耐受状态的作用机制奠定基础。方法:一、LPS耐受细胞模型的建立小鼠腹腔巨噬细胞经小剂量的LPS5(5 ng/m L)处理4 h后,使用VP-16使用方法大剂量的LPS100(100 ng/m L)再次处理4 h,ELISA法检测细胞培养上清中的前炎症细胞因子TNF-α、IL-6的水平,明确LPS耐受细胞模型是否建立成功。二、青蒿琥酯对LPS耐受细胞上清中TNF-α、IL-6释放的影响在LPS耐受细胞模型Pathologic factors中,加入大剂量的LPS100(100 ng/m L)处理的同时给予20μg/m L的AS作用4 h,ELISA法检测细胞上清中的前炎症细胞因子TNF-α、IL-6的水平,明确AS逆转LPS耐受状态的作用。三、明确小鼠腹腔巨噬细胞膜上存在mVDR1.小鼠腹腔巨噬细胞膜上VDR的分布情况绿色荧光的异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记VDR,分别用红色荧光的细胞膜染料DIL染色细胞膜、红色荧光Alexa Fluor 594荧光标记细胞膜受体CD64、四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamine isothiocynate,TRITC)标记的鬼笔环肽染色细胞骨架,激光共聚焦显微镜观察VDR与细胞膜或细胞骨架荧光标记分子的共定位情况,明确mVDR的存在。2.细胞膜蛋白提取物中VDR含量的检测提取细胞膜蛋白,小鼠VDR ELISA试剂盒检测膜蛋白的VDR水平,明确mVDR的存在,并统计分析各组mVDR蛋白的变化。四、青蒿琥酯对mVDR在LPS耐受细胞中分布的影响1.将156μM的VDR野生肽、突变肽分别和青蒿琥酯预孵2 h,然后将多肽预孵后的AS、未处理的AS分别作用于LPS耐受细胞4 h,ELISA法检测多肽对AS增加LPS耐受细胞释放TNF-α能力的影响;2.将156μM的人VDR野生肽h H305、突变肽h H305A与AS预孵,然后将多肽预孵后的AS、未处理的AS分别作用于LPS耐受细胞,绿色荧光的FITC标记VDR,红色荧光Alexa Fluor 594荧光标记细胞膜受体CD64,激光共聚焦显微镜观察VDR与细胞膜的共定位,明确VDR多肽对AS改变mVDR水平的影响;3.将含mVDR细胞膜蛋白的提取物加入预包被VDR抗体的ELISA孔板中,mVDR即被捕获于孔板上,接着使用抗VDR抗体封闭孔板上的mVDR的部分位点,再给予异硫氰酸荧光素标记的青蒿琥酯(FITC-AS)与孔板上mVDR孵育2 h,ELISA法检测各组FITC-AS的荧光强度,根据荧光强度的变化,明确AS与mVDR的结合;4.将VDR的天然配体骨化三醇(calcitriol,CAL)与FITC-AS同时处理LPS耐受细胞、单独的FITC-AS处理LPS耐受细胞,激光共聚焦显微镜观察FITC-AS的绿色荧光变化,说明骨化三醇和FITC-AS对VDR的竞争结合,明确AS与VDR的结合;5.青蒿琥酯作用于RAW264.7细胞LPS耐受模型后,不使用破膜剂,使用荧光FITC-VDR抗体标记mVDR,采用流式细胞术检测mVDR的荧光强度,明确青蒿琥酯对mVDR水平的影响。6.青蒿琥酯作用于小鼠腹腔巨噬细胞LPS耐受模型后,提取细胞膜蛋白,采用WB法及ELISA法分别检测膜蛋白提取物中的mVDR水平,明确青蒿琥酯对mVDR水平的影响。五、青蒿琥酯对LPS耐受小鼠肺组织前炎症细胞因子和VDR水平的影响1.BALB/c小鼠连续3天腹腔注射剂量为0.3 mg/kg的LPS,第4天尾静脉注射剂量为50 mg/kg的LPS,ELISA法检测血清、脾和肺组织中TNF-α、IL-6和IL-1β的水平,建立LPS耐受小鼠模型;2.LPS耐受组小鼠在给予50 mg/kg的LPS后0 h及4 h,分别肌肉注射剂量为10mg/kg的AS,ELISA法检测AS对LPS耐受小鼠肺组织TNF-α、IL-6水平的影响;3.免疫组化法检测AS对LPS耐受小鼠肺组织VDR水平的影响。结果:一、成功建立LPS耐受细胞模型LPS耐受细胞释放的前炎症细胞因子TNF-α、IL-6的水平较单独的大剂量LPS处理组显著降低,表明LPS耐受细胞模型建立成功。二、青蒿琥酯能逆转LPS耐受状态AS可显著增加LPS耐受细胞上清中TNF-α、IL-6的水平,表明AS能逆转细胞的LPS耐受状态。三、明确小鼠腹腔巨噬细胞膜上存在mVDR1.激光共聚焦显微镜下观察到VDR与DIL染色的细胞膜、CD64以及细胞骨架均存在共定位,表明小鼠腹腔巨噬细胞膜上存在mVDR;2.ELISA结果显示,细胞膜蛋白提取物中存在VDR,且LPS耐受组mVDR水平较非耐受组显著上升。四、青蒿琥酯对mVDR在LPS耐受细胞中分布的影响1.ELISA结果显示,VDR野生肽能改变AS增加LPS耐受细胞释放TNF-α、IL-6的作用,VDR突变肽则不会影响;2.激光共聚焦结果显示,VDR野生肽H305能改变AS降低LPS耐受细胞mVDR的作用,VDR野生肽H305A不影响;3.ELISA结果显示,抗VDR抗体的处理能降低FITC-AS的荧光强度,表明FITCAS能与mVDR结合;4.激光共聚焦显微镜下观察到,FITC-AS与骨化三醇合用,其荧光强度较单独的FITC-AS处理组显著降低,表明骨化三醇与FILiraglutide浓度TC-AS竞争结合VDR;5.流式细胞术的结果显示,AS能降低RAW264.7细胞LPS耐受模型mVDR水平。6.WB、ELISA的结果显示,AS能降低小鼠腹腔巨噬细胞LPS耐受模型的mVDR水平。五、青蒿琥酯对LPS耐受小鼠肺组织中前炎症细胞因子和VDR表达水平的影响1.LPS耐受组小鼠血清、脾和肺组织TNF-α、IL-6和IL-1β的水平比50 mg/kg的LPS攻击组小鼠明显减少,表明LPS耐受小鼠模型建立成功;2.AS能增加LPS耐受小鼠模型肺组织TNF-α、IL-6的释放;3.AS能降低LPS耐受小鼠肺组织VDR水平。结论:1.青蒿琥酯能显著增加LPS耐受细胞释放前炎症细胞因子;2.小鼠腹腔巨噬细胞膜上存在mVDR,且mVDR在LPS耐受状态下处于高水平;3.青蒿琥酯能与小鼠腹腔巨噬细胞膜上的mVDR结合并能降低其水平,发挥逆转细胞LPS耐受状态的作用;4.青蒿琥酯能降低LPS耐受模型小鼠肺组织VDR的水平,发挥逆转小鼠LPS耐受状态的作用。