近年来,2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)的发病率随着人们生活方式的改变而逐年增加,发病年龄也逐渐低龄化,已成为全世界严重的健康问题。与此同时,生活方式改变引起的血脂代谢紊乱也日益严重。研究发现,脂代谢紊乱可促进T2DM的发生。因此,积极控制脂代谢紊乱可以从一定程度上预防T2DM。胰岛β细胞在调节血糖平衡中起着关键作用,其功能受损是引起糖尿病的重要因素,并且可先于临床确诊T2DM 10余年就开始出现β细胞功能异常。而β细胞功能受损主要体现在β细胞数量的减少和功能的下降。长期以来,人们将其归因于β细胞凋亡,但随着研究的深入,研究者发现β细胞去分化也是导致β细胞功能下降的重要原因。胰岛β细胞在代谢应激的刺激下可发生去分化,虽可暂时逃避凋亡,但同时也失去了胰岛素合成及分泌的能力。因此,预防β细胞去分化或使去分化后的β细胞再分化已成为研究T2DM的新领域。白藜芦醇(Resveratrol,RSV)是一种具有广泛生物活性的天然植物化合物。前期本课题组对RSV在糖脂代谢中的作用进行了深入研究,发现RSV可通过多种机制发挥降脂、降糖、改善胰岛素敏感性的作用。不仅如此,RSV还可以直接作用于胰岛β细胞刺激胰岛素分泌。Jennifer L等发现RSV可预防高脂肪/高糖饮食动物的β细胞去分化,但后续相关研究较少,机制尚不明确。因此,本研究选择正常糖耐量人群通过口服脂肪耐量试验(Oral fat tolerance test,OFTT),按照空腹血脂和餐后血脂分为不同脂代谢状态人群,以明确脂代谢障碍对于胰岛素敏感性及胰岛β细胞功能的影响;然后进一步用高脂饮食诱导的高脂血症金黄地鼠了解脂代谢紊乱对胰岛β细胞功能的影响;最后利用高脂金黄地鼠模型和棕榈酸(Palmitic acid,PA)干预的MIN6细胞模型,探讨RSV是否可通过逆转胰岛β细胞去分化而防止胰岛β细胞功能受损,为RSV调节糖脂代谢提供新的靶点。第一部分不同脂耐量人群血脂与胰岛β细胞功能和胰岛素抵抗相关性的研究目的:本研究通过行OFTT,比较糖耐量正常但脂代谢状态不同的人群胰岛素分泌和胰岛素抵抗的变化,目的在于探讨脂代谢紊乱对胰岛β细胞功能和胰岛素抵抗的影响,为更早期地预防糖尿病的发生提供可能。方法:选取248名口服葡萄糖耐量试验(Oral glucose tolerance test,OGTT)正常的志愿者进行OFTT,根据空腹甘油三酯(Triglycerides,TG)1.7mmol/L及脂餐后4h TG 2.5mmol/L将人群分为三组:(1)脂耐量正常组(Normal fat tolerance,NFT),(2)脂耐量减低组(Impaired fat tolerance,IFT);(3)高甘油三酯血症组(Hypertriglyceridemia,HTG)。比较不同组之间基线及餐后血脂的变化。采用早期胰岛素分泌功能指数(IGI_(30))、Homa-β、葡萄糖处置指数(Disposition index,DI)评价胰岛β细胞功能。采用Homa-IR评估胰岛素抵抗,采用松田胰岛素敏感性指数(ISI_M)评估胰岛素敏感性。将非正态分布的变量ISI_M和DI转换为正态分布的变量Ln ISI_M和Ln DI。采用多元线性回归分析评估血脂与胰岛素抵抗、胰岛素敏感性和β细胞功能之间的相关性。结果:1.三组人群基线数据的比较三组人群的收缩压、舒张压、腰围、BMI、空腹TG、TC、LDL-C、血糖、胰岛素均随脂耐量减低而逐渐升高,而HDL-C随之降低,三组间差异明显。2.三组人群口服脂肪耐量试验餐后血脂变化NFT、IFT、HTG三组人群高脂餐负荷后TG达峰时间逐渐延迟,分别为2h、4h、6h。同时在NFT组及IFT组,TG在10h已降至基线水平;而在HTG组,TG在10h仍未降至基线水平。各时间点的TG及TG的曲线下面积(Area under the curve,AUC)在三组人群中差异明显。而TG的曲线下面积增量(Incremental area under the curve,i AUC)在IFT及HTG两组间无差异。三组人群OFTT期间TC、HDL-C、LDL-C变化幅度不大,且各时间点TC、LDL-C均随脂耐量减低逐渐增高,而HDL-C随之降低。3.三组人群口服葡萄糖耐量试验期间血糖和胰岛素的比较三组人群OGTT期间血糖在不同时间点上随着脂耐量减低而逐渐升高,其中仅糖负荷后1h血糖、AUCglu三组间差异有统计学意义。三组人群胰岛素水平在不同时间点上也随着脂耐量减低而逐渐升高,IFT组及HTG组相较NFT组胰岛素达峰时间延迟,并且三组间仅在空腹及糖负荷后1h及AUCins差异有统计学意义。4.三组人群胰岛素敏感性及胰岛β细胞功能的比较随着脂耐量减低,三组人群的Homa-IR逐渐升高,ISI_M逐渐下降,各组间差异明显。而IGI_(30)在三组间无显著差异,但调整了胰岛素抵抗的混杂因素后DI逐渐下降,三组间各组间差异明显。5.胰岛素敏感性及胰岛β细胞功能的影响因素在多元线性回归分析中,调整了年龄、BMI、0h HDL-C和0h LDL-C后,0h和4h TG分别是Ln ISI_M的独立危险因素。在校正了男性、年龄、有无高血压、BMI和0h HDL-C后,0h和4h TG分别是Ln DI的独立危险因素。小结:1.在葡萄糖耐量正常的个体中,β细胞功能和胰岛素敏感性随着脂耐量的下降而逐渐降低。2.不仅是空腹TG,餐后TG也是β细胞功能受损和胰岛素抵抗的独立危险因素。第二部分高脂饮食对金黄地鼠胰岛细胞和功能的影响及白藜芦醇的干预研究目的:使用高脂饲料喂养金黄地鼠,了解其糖脂代谢情况,并明确其胰岛β细胞的功能状态,给予RSV干预后,验证其是否可以通过逆转胰岛β细胞去分化来改善胰岛β细胞功能。方法:将金黄地鼠随机分为2组,对照组(CON)饲喂普通饲料,高脂组(HF)饲喂高脂饲料,饮食干预12周末评估所有金黄地鼠的糖脂代谢情况。动物模型建立成功后,从HF组随机抽取10只给予RSV以100mg/kg/d灌胃,作为高脂+白藜芦醇组(HF+RSV),而CON组及HF组给予0.9%氯化钠注射液灌胃。整个喂养过程中每周监测体重、进食量,每2周经眼底静脉丛采血用血糖仪检测空腹血糖,留取血清用生化法检测血脂;在前期高脂饮食干预的第12周末及后期RSV药物干预的第12周末,分别行腹腔内注射葡萄糖耐量试验(Intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT)及在体葡萄糖刺激胰岛素分泌试验(Glucose-stimulated insulin secretion,GSIS),通过血糖仪检测不同时间点血糖,同时留取血清以备后期用ELISA法检测胰岛素、胰高血糖素。完成上述相关试验后,处死金黄地鼠,留取血清及胰腺组织。对胰腺组织进行H&E染色、免疫荧光双染色了解胰腺组织形态学变化,并测量胰腺组织中TC、TG含量。最后通过RT-PCR和Western blot检测胰岛β细胞功能及去分化标志物,同时用Western blot检测PI3K/Akt/FOXO1信号通路的关键分子蛋白及磷酸化表达水平。结果:1.高脂饮食喂养12周金黄地鼠的代谢评估HF组的金黄地鼠从高脂喂养第2周开始至第12周结束体重均明显高于CON组。同时,HF组的金黄地鼠TC、TG、HDL-C从高脂喂养的第2周开始,LDL-C从第8周开始,至12周结束均明显高于CON组。在整个高脂饮食喂养的造模过程中,HF组和CON组的空腹血糖无明显差异。但是,在第12周末行IPGTT,可见HF组糖负荷后各时间点血糖、2h AUCglu及2h i AUCglu均较CON组明显升高,存在糖耐量减低。HF组在空腹、高糖负荷后各时间点的胰岛素及2h AUCins、2h i AUCins均较CON组明显升高,提示存在高胰岛素血症。但在GSIS试验中,HF组糖负荷后2min胰岛素及5min i AUCins反而较CON组明显减少,提示HF组金黄地鼠胰岛β细胞第一时相胰岛素分泌功能下降。进一步计算验证了HF组的Homa-IR明显高于CON组,QUICKI、IGI_(30)、DI明显低于CON组。另外,在IPGTT中,虽然空腹胰高血糖素在两组间无明显差异,但是HF组糖负荷后各时间点的胰高血糖素均高于CON组,且HF组2h AUCglucagon也较CON组明显升高,提示HF组金黄地鼠在高糖负荷后胰高血糖素分泌抑制明显受损,引起餐后高胰高血糖素血症,进一步加重糖耐量减低。2.在高脂饮食喂养的基础上,白藜芦醇药物干预12周后金黄地鼠的代谢评估在高脂饮食喂养的基础上,RSV干预后从第7周开始至第12周结束HF+RSV组的体重均明显低于HF组,但仍明显高于CON组。并且HF+RSV组的TC、TG从RSV干预后第4周起,LDL-C从RSV干预后第8周起均明显低于HF组,此差异一直持续至第12周结束。但是HDL-C在整个RSV干预过程中虽HF+RSV组稍低于HF组,但差异无统计学意义。在RSV干预12周末,HF组的游离脂肪酸(Free fatty acid,FFA)较CON组明显升高,而HF+RSV组的FFA较HF组明显下降。另外,在RSV干预过程中,三组间的空腹血糖仍无明显差异。在RSV干预后的第12周末再次行IPGTT,可见HF+RSV组糖负荷后各时间点的血糖及2h AUCglu、2h i AUCglu均明显低于HF组。同时,IPGTT中HF+RSV组空腹及糖负荷后各时间点胰岛素、2h AUCins、2h i AUCins均明显低于HF组。在RSV干预12周后再次行GSIS试验,HF+RSV组糖负荷后2min胰岛素及5min i AUCins均明显高于HF组。进一步计算可知HF+RSV组Homa-IR明显低于HF组,而QUICKI、IGI_(30)、DI明显高于HF组。提示RSV可改善高脂饮食喂养的金黄地鼠胰岛素抵抗,提高胰岛素敏感性,提高胰岛β细胞功能。另外,在IPGTT中,HF+RSV组糖负荷后各时间点胰高血糖素及2h AUCglucagon明显低于HF组。3.白藜芦醇干预可改善高脂诱导的金黄地鼠胰腺组织形态学受损在H&E染色中,CON组金黄地鼠的胰岛边界清楚,细胞核深染,排列整齐,胰岛周围的腺小叶及结缔组织清晰可辨。HF组金黄地鼠的胰岛边界模糊,多数胰岛细胞呈空泡变性,细胞核结构不清,胰岛周围部分腺泡细胞也呈空泡变性。而在HF+RSV组中,胰岛细胞及胰岛周围腺泡细胞的空泡变性明显减轻,细胞核结构也较前清Whole Genome Sequencing晰。在胰岛素-胰高血糖素免疫荧光双染色中,经过定量分析,可知HF组胰岛面积高于CON组及HF+RSV组,但三组间无明显统计学差异。与CON组相比,HF组β细胞量明显增加,但是胰岛中β细胞面积及β细胞相对容积明显下降,α细胞面积、α细胞量及胰岛中α细胞相对容积明显增加,进而导致HF组β细胞与α细胞量的比值明显下降。RSV干预后相较HF组,HF+RSV组中β细胞面积、β细胞相对容积明显增加,α细胞面积、α细胞量及胰岛中α细胞相对容积明显下降,从而导致β细胞与α细胞量的比值明显增加。4.白藜芦醇干预可减少高脂饮食喂养的金黄地鼠的胰腺脂质沉积虽三组金黄地鼠胰腺组织中TC含量无明显差异,但HF组胰腺组织中TG含量较CON组明显升高,而HF+RSV组TG含量较HF组明显下降。5.白藜芦醇干预可改善高脂饮食喂养造成的金黄地鼠胰岛β细胞功能下降及去分化通过RT-PCR检测胰腺组织中胰岛β细胞成熟标志物Pdx-1、Mafa的m RNA水平,及去分化前体细胞标志物Neurogenin3的m RNA水平。与CON组比较,HF组Pdx-1、Mafa的m RNA明显下降,Neurogenin3的m RNA明显升高。HF+RSV组Pdx-1、Mafa的m RNA明显高于HF组,而Neurogenin3明显低于HF组。进一步用Western blot检测Pdx-1、Neurogenin3的蛋白表达情况,其变化趋势与其相应的m RNA水平一致。6.白藜芦醇干预对高脂饮食喂养的金黄地鼠胰腺组织中PI3K/Akt/FOXO1信号通路的影响Western blot检测结果显示,HF组金黄地鼠胰腺组织中p-Akt/Akt、p-FOXO1/FOXO1的蛋白表达相较CON组明显下降,而RSV的干预可明显提高HF+RSV组p-Akt/Akt、p-FOXO1/FOXO1的蛋白表达。小结:1.高脂饮食诱导的脂代谢异常金黄地鼠可表现胰腺组织脂质沉积,导致胰岛β细胞和α细胞功能受损,以及胰岛素抵抗。2.白藜芦醇能改善高脂饮食诱导的金黄地鼠糖脂代谢紊乱、胰岛功能和胰岛素抵抗;逆转高脂诱导的胰岛β细胞去分化,通过调控PI3K/Akt/FOXO1信号通路可能是其实现该作用的机制。第三部分白藜芦醇通过PI3K/Akt/FOXO1信号通路调节棕榈酸诱导的MIN6细胞去分化目的:通过在体外用PA诱导MIN6细胞,在细胞水平上验证RSV是否可通过PI3K/Akt/FOXO1信号通路调节胰岛β细胞的去分化。方法:通过用不同浓度的PA及RSV分别干预并培养MIN6细胞,利用CCK-8法检测各组细胞存活率,从而选取最终合适的PA造模浓度及RSV干预浓度。用0.3mmol/L PA孵育MIN6细胞24h后,再用10μmol/L RSV联合干预24h后行油红O染色。进一步联合PI3K抑制剂LY29400210μmol/L进行干预,最终分为5组:对照组(CON)、棕榈酸组(PA)、棕榈酸+白藜芦醇组(PA+RSV)、棕榈酸+白藜芦醇+PI3K抑制剂组(PA+RSV+LY)、棕榈酸+PI3K抑制剂组(PA+LY)。对上述五组进行GSIS试验,用ELISA法检测各组在GSIS试验中的胰岛素。最后通过RT-PCR和免疫荧光染色检测胰岛β细胞功能及去分化标志物,并用Western blot法检测PI3K/Akt/FOXO1信号通路的关键分子蛋白及磷酸化表达水平。结果:1.确定棕榈酸造模浓度及白藜芦醇的药物干预浓度首先分别用不同浓度的PA干预MIN6细胞,通过CCK-8法检测MIN6细胞的存活率,同时结合PA干预后MIN6细胞的镜下表现,最终选择0.3mmol/L作为后续试验中PA诱导MIN6细胞建立脂毒性模型的干预浓度。然后再用不同浓度的RSV分别干预MIN6细胞及PA干预的MIN6细胞,通过CCK-8法检测细胞的存活率。在PA干预的基础上,RSV10μmol/L可使细胞存活率较PA组显著增加,故最终选择10μmol/L作为RSV药物干预浓度。2.白藜芦醇干预可改善棕榈酸诱导MIN6细胞的镜下形态在PA干预的基础上,联合RSV处理后PA+RSV组MK-4827 IC50细胞镜下形态较PA组明显改善,漂浮及脱落细胞减少,细胞形态趋于正常,大部分细胞重新长出长尾和角。3.白藜芦醇干预可减轻棕榈酸诱导MIN6细胞的脂质沉积油红O染色可见,相较于CON组,PA组MIN6细胞胞浆内可见大量橘红色的脂滴,而PA+RSV组细胞胞浆中橘红色脂滴明显减少。4.白藜芦醇干预可改善棕榈酸诱导MIN6细胞的胰岛素分泌受损在GSIS试验中,在2.8mmol葡萄糖溶液的孵育下,PA组、PA+RSV组、PA+RSV+LY组、PA+LY组均较CON组胰岛素明显增加;而在16.7mmol/L葡萄糖溶液的刺激下,PA组的胰岛素较CON组明显下降,而PA+RSV组的胰岛素较PA组明显增加,但加入PI3K抑制剂LY294002后,则PA+RSV+LY组胰岛素又回到PA组水平,两组间差异无统计学意义。5.白藜芦醇干预可改善棕榈酸诱导MIN6细胞的去分化用RT-PCR检测各组MIN6细胞成熟胰岛β细胞特异性标志物Pdx-1、Mafa及去分化前体细胞标志物Neurogenin3的m RNA的表达情况。PA组Pdx-1、Mafa的m RNA表达较CON组明显下降,而Neurogenin3的m RNA表达明显增加,PA+RSV组的Pdx-1、Mafa m RNA的表达较PA组明显增加,而Neurogenin3的表达较PA组明显降低。但是加入PI3K抑制剂LY294002,则逆转了RSV的上述作用,使上述分子的m RNA的表达水平又回到PA组的水平。用免疫荧光染色检测各组MIN6细胞的胰岛素INS、Pdx1、Neurogenin3的表达。结果显示,相对于CON组,PA组的INS、Pdx-1的表达明显减少,而Neurogenin3的表达明显增加。而相较于PA组,PA+RSV组的INS、Pdx-1表达明显增加,而Neurogenin3的表达明显减少。但是加入PI3K抑制剂LY294002,PA+RSV+LY组的INS、Pdx-1、Neurogenin3的表达则基本回到PA组的表达水平。6.白藜芦醇改善棕榈酸诱导MIN6细胞去分化是通过调节PI3K/Akt/FOXO1信号通路与CON组相比,PA组p-Akt/Akt及p-FOXO1/FOXO1的蛋白表达明显下降。而与PA组相比,PA+RSV组p-Akt/Akt、p-FImidazole ketone erastin molecular weightOXO1/FOXO1蛋白表达明显升高,加入LY294002后,PA+RSV+LY组的p-Akt/Akt、p-FOXO1/FOXO1的蛋白表达水平又降至PA组水平。且p-Akt/Akt、p-FOXO1/FOXO1在各组中的表达水平,与GSIS试验中各组胰岛素分泌水平相对应,进一步证明RSV是通过激活PI3K/Akt/FOXO1信号通路改善PA诱导的MIN6细胞去分化,从而提高胰岛β细胞的胰岛素分泌功能。通过对各组MIN6细胞进行FOXO1的免疫荧光染色发现,RSV在增加FOXO1磷酸化的基础上,可抑制PA诱导的FOXO1核异位及积累,使FOXO1更多的在细胞浆中表达,而同时加入PI3K抑制剂LY294002后,可再次抑制FOXO1磷酸化,使更多的FOXO1易位到细胞核内集聚。小结:白藜芦醇可通过激活PI3K/Akt/FOXO1信号通路,抑制FOXO1的核聚集,而发挥逆转PA诱导的胰岛β细胞去分化的作用。结论:1.空腹和餐后TG升高均是β细胞功能受损和胰岛素抵抗的独立危险因素。2.高脂饮食诱导的脂代谢异常金黄地鼠可表现胰腺组织脂质沉积,导致胰岛β细胞和α细胞功能受损,以及胰岛素抵抗。3.白藜芦醇能改善高脂饮食诱导的金黄地鼠糖脂代谢紊乱、胰岛功能和胰岛素抵抗;可逆转高脂诱导的胰岛β细胞去分化,通过调控PI3K/Akt/FOXO1信号通路是其实现这一调节的机制之一。