目的:结肠直肠癌(colorectal cancer,CRC)目前已成为我国和西方国家发病率仅次于肺癌和乳腺癌的癌症。肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)可通过分泌细胞因子与肿瘤细胞相互作用,参与CRC进程,且具有较高的可塑性和异质性,大量证据显示TAMs的表型和浸润与CRC患者的预后有关。白头翁属毛茛科多年生草本植物,其多种成分具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒以及免疫调节等药效作用。本论文的研究目的为白头翁不同成分对TAMs表型M1/M2转化的调控效果进行深入研究,同时需明确其与CRC治疗效果的关联性,以期阐明其抗CRC的分子作用机制。方法:1、运用 OMIM、GeneCard、DisGeNET、TCMSP、BATMAN-TCM、GEO等数据库和数据平台,对结直肠癌疾病相关靶点、白头翁活性成分及对应靶点、巨噬细胞极化相关靶点进行筛选,并构建药物调控网络及PPI蛋白互作网络,接着使用Cytoscape软件和R软件包对筛选获得的白头翁成分-结直肠癌-巨噬细胞极化的共同靶点进行基因本体(Gen Ontology,GO)富集分析和KEGG通路分析,分别从基因功能和通路分析两个方面解释相关生物学功能。2、采用CCK8法测定白头翁不同成分对不同细胞SW480、HCT116、FHC和BMDM存活率的影响,考察药物对结直肠癌细胞的细胞毒作用以及对正常细胞生长抑制的影响;RT-qPCR法分别检测BMDM诱导的M1、M2型selleckchem Ipatasertib巨噬细胞标志性基因mRNA的表达以及白头翁不同成分的干预作用;流式细胞术分别检测BMDM诱导的M1、M2型巨噬细胞表面标志物的表达,以及白头翁不同成分干预后的影响。3、对于进一步筛选到的白头翁成分,采用CCK8检测其对SW480、HCT116人结肠癌细胞、小鼠CT26结肠癌细胞、小鼠BMDM细胞、THP-1人单核细胞的生存率的影响;选择小鼠骨髓来源的巨噬细胞BMDM和小鼠结直肠癌细胞CT26建立Transwell共培养系统;考察药物通过调控巨噬细胞M1、M2极化对共培养体系中CT26生长增殖的影响;分别收集药物干预后小鼠来源与人源巨噬细胞的条件培养基,并通过超滤管离心对其进行蛋白浓缩,CCK-8检测条件培养基浓缩液对小鼠结肠癌细胞CT26或人结直肠癌细胞SW480增殖的影响;通过平板克隆实验检测23-HBA干预后巨噬细胞条件培养基对SW480细胞克隆球形成能力的影响;4、建立小鼠结直肠癌CT26皮下移植瘤模型;分别采用腹腔注射与尾静脉注射23-HBA评价药物抗结肠癌的体内作用。观察指标包括动物体重检测、瘤重及抑瘤率、脏器系数、外周血细胞分析,免疫荧光检测肿瘤组织中巨噬细胞表面marker的表达(CD68、CD86和CD206),流式细胞术检测肿瘤组织中不同表型巨噬细胞的数量比例。为了进一步确定巨噬细胞在药物23-HBA抗结肠癌中的作用,在通过氯膦酸二钠脂质体耗竭小鼠体内巨噬细胞的基础上,给小鼠接种CT26肿瘤细胞,观察腹腔注射23-HBA对结肠癌荷瘤小鼠抑瘤率的影响,同时采用流式细胞仪检测荷瘤小鼠脾脏和肿瘤组织中巨噬细胞的耗竭程度。5、通过Transwell小室构建CT26/BMDM共培养体系将BMDM诱导为TAMs;通过qPCR检测23-HBA对TAMs不同表型标志性基因表达的影响;通过Western Blot检测调控TAMs极化相关蛋白的表达;采用分子对接进一步确定23-HBA与STAT3的结合活性。结果:1、通过网络药理学筛选到21个白头翁潜在活性成分,其中大部分都已被报道具有抗肿瘤作用。对筛选到的21个潜在活性成分进一步分析,根据该成分是否为白头翁的特征性成分或主要活性成分以及参考其在白头翁中的含量,并结合文献对其抗肿瘤活性或免疫调节功能的报道,最终筛选出10个备选化合物,分为6种类别:①小分子类成分:白头翁素;②香豆素类成分:滨蒿内酯、白蜡树精;③三帖酸类成分:23-羟基白桦酸、常春藤皂苷元、齐墩果酸、熊果酸;④黄酮类成分:异鼠李素;⑤生物碱类成分:蝙蝠葛碱;⑥类固醇类成分:胡萝卜苷。而根据课题组前期研究基础,对数据库中收录信息较少的白头翁三萜皂苷类成分进行增补,将白头翁皂苷B4、白头翁皂苷A3、白头翁皂苷D、α-常春藤皂苷和黑海常春藤皂苷确定为具有潜在活性的备选化合物。因此确定了 15个化合物作为潜在活性成分进行下一步筛选实验。2、从对M1型巨噬细胞极化的影响结果可以看出,在筛选的药物成分中白头翁皂苷A3和23-羟基白桦酸能明显促进巨噬细胞M1型极化,且表现出明显的量效关系,α-常春藤皂苷对M1型极化也有一定的促进作用,因此选择白头翁皂苷A3、23-羟基白桦酸和α-常春藤皂苷作为后续实验中促进M1型极化的白头翁有效成分;从对M2型巨噬细胞极化的影响结果可以看出,在筛选的药物成分中白头翁皂苷B4、23-羟基白桦酸能够明显抑制巨噬细胞M2型极化相关基因Arg1、CD206以及Fizz1,且表现出明显的量效关系;白头翁皂苷A3也表现出较好的抑制M2型极化的作用,因此选择白头翁皂苷B4、23-羟基白桦酸和白头翁皂苷A3作为后续实验中抑制M2型极化的白头翁有效成分。3、白头翁有效成分通过不同途径对结直肠癌细胞BI 10773核磁增殖的抑制作用:①药物单独对不同细胞的抑制率:CCK8结果显示23-羟基白桦酸和α-常春藤皂苷对结肠癌细胞有较好的敏感性;23-羟基白桦酸对肿瘤细胞表现出一定的选择性。②药物通过共培养体系对结肠癌细胞的抑制作用:共培养体系中,20μg/mL、10μg/mL的23-HB A和50μg/mL的A3表现出对肿瘤细胞明显的抑制作用,且相较与单独作用肿瘤细胞时抑制率有升高趋势。因此说明药物在某种程度上能够通过促进M1巨噬细胞极化增加对肿瘤细胞的抑制作用。在CT26与M2型巨噬细胞的共培养条件下,药物与单独作用于肿瘤细胞相比,对肿瘤细胞生长的影响没有明显改变。药物没有表现出通过对巨噬细胞M2型极化的抑制而达到抗肿瘤细胞的作用。③药物干预后的巨噬细胞条件培养基抑制肿瘤生长:无论是BMDM细胞还是TPH-1诱导的巨噬细胞,巨噬细胞M1的培养上清能明显抑制结直肠癌细胞CT26的增殖,药物23-羟基白桦酸高低剂量的培养上清对肿瘤细胞增殖具有明显的抑制作用,且有一定的剂量依赖性;巨噬细胞M2的培养上清能在一定程度上促进结直肠癌细胞CT26的增殖,与M2培养上清组比较,药物23-羟基白桦酸高低剂量干预后对肿瘤细胞生长具有明显的抑制作用,且有一定的剂量依赖性。④细胞平板克隆实验:结果显示,与M0组相比,M2组的克隆球数量明显增加,可以促进SW480的增殖;23-HBA高低剂量组干预后的巨噬细胞上清液可以明显抑制M2的促增殖作用,肿瘤细胞克隆球数量明显减少。4、23-HBA抗小鼠结肠癌动物实验结果表明,①第一批动物实验(腹腔注射23-HBA;小鼠CT26移植瘤模型):23-HBA高低剂量对动物体重无明显影响,说明药物对小鼠无毒性表现;23-HBA腹腔注射对小鼠结肠癌的生长具有明显的抑制作用,低剂量15mg/kg与高剂量30mg/kg的抑瘤率分别为34.8%和51.7%;免疫器官脏器指数方面,23-HBA高剂量能够抑制模型组脾脏指数的异常升高,对胸腺指数无明显影响;血细胞分析结果看出,23-HBA能够抑制模型组单核细胞的异常升高,对其他中性粒或淋巴细胞无明显影响;肿瘤组织细胞悬液的流式结果显示,32-HBA腹腔注射高低剂量能减少肿瘤组织中巨噬细胞总数的同时,明显降低M2型巨噬细胞所占比例,23-HBA高低剂量将肿瘤组织中M1/M2的比例从1:5.4明显升高至1:2.3和1:3.0;免疫组织荧光结果反映23-HBA高低剂量能明显减少肿瘤组织中巨噬细胞CD68和CD206的表达,而CD86的表达有增加的趋势;以上结果说明23-HBA能够使肿瘤微环境中TAMs的表型由M2型向M1型偏移。②第二批动物实验(腹腔注射23-HBA;巨噬细胞耗竭小鼠CT26移植瘤模型):在尾静脉注射氯膦酸二钠脂质体至小鼠体内后,23-HBA对CT26荷瘤小鼠的抑瘤率由34.6%下降至4.8%,同时流式细胞仪结果显示,注射氯膦酸二钠脂质体后,无论是脾脏还是肿瘤组织中,巨噬细胞数量均明显减少了大约90%;由此推测,药物23-HBA对肿瘤的抑制作用是由体内巨噬细胞所介导。③第三批动物实验(尾静脉注射23-HBA;小鼠CT26移植瘤模型):静脉注射23-HBA30mg/kg剂量组抑瘤率达77.03%,对小鼠体重仍未产生影响,没有表现出药物毒性。在脏器指数、外周血细胞数量方面与之前实验结果基本一致。流式细胞仪结果显示,尾静脉注射23-HBA能明显升高肿瘤组织中巨噬细胞M1型数量,减少M2型数量,明显上调巨噬细胞M1/M2的比例。5、23-羟基白桦酸调控TAMs表型转化的分子机制:①TAMs极化相关基因表达:qPCR结果显示,与M0型BMDM 比较,在体外共培养体系中诱导的TAMs,其M2表型相关基因MRC-1、Arg-1、CCL2和Fizz1的mRNA水平均明显升高;M1表型相关基因TNF-αstimuli-responsive biomaterialsmRNA表达水平明显降低;其他M1表型基因如iNOS、IL-1b和IL-12b表达也有不同程度的升高。23-HBA干预后能够明显抑制MRC-1、Arg-1、CCL2和Fizz1等M2相关基因的表达,明显升高TNF-α、iNOS和IL-1b等M1相关基因的表达,而对IL-12b基因表达无明显影响。②TAMs极化相关蛋白表达:WB结果显示,TAMs的p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3蛋白水平明显升高,p-NF-kB蛋白表达有所降低;23-HBA干预后对p-JAK1和p-JAK2表达无明显影响,但明显降低TAMs的p-STAT3蛋白表达,同时明显升高p-NF-kB蛋白表达,而各组Toatl JAK1、JAK2,STAT3和NF-kB蛋白表达无明显差异。③靶蛋白验证:AutoDock分子对接结果显示,药物23-HBA与鼠源蛋白的结合能为-5.98,与人源蛋白的结合能为-7.14,表明23-HBA对小鼠和人源的STAT3蛋白均有较好的结合活性。结论:1、通过网络药理学的分析预测,我们检索筛选到15个白头翁活性成分与白头翁调控巨噬细胞极化抗结直肠癌作用有潜在关联,因此作为潜在活性成分进行下一步体外验证试验。2、通过qPCR和流式检测,筛选出白头翁皂苷A3、23-羟基白桦酸和α-常春藤皂苷对促进巨噬细胞M1型极化具有明显作用;白头翁皂苷B4、23-羟基白桦酸和白头翁皂苷A3对抑制巨噬细胞M2型极化具有显著作用;因此选择该成分进行下一步抗肿瘤试验。3、通过肿瘤细胞/巨噬细胞共培养体系和收集巨噬细胞条件培养基的方式以及细胞平板克隆实验,证明了 23-HBA能够通过促进巨噬细胞M1型极化增加其对肿瘤的抑制作用;同时能够通过抑制巨噬细胞M2型极化抑制肿瘤细胞的生长。同时数据显示出23-HBA对结肠癌肿瘤细胞可能具有一定的选择性细胞毒性作用。4、在抗小鼠结肠癌动物实验中,尾静脉注射23-HBA能明显抑制CT26结肠癌的体内生长,且对动物体重、脏器指数等无明显影响。研究进一步显示23-HBA在体内对结肠癌的抑制作用与巨噬细胞的参与有关;23-HBA能够升高TAMs中M1型巨噬细胞的比例,降低M2型的比例,升高M1/M2细胞的比值。5、23-HBA能够将体外共培养体系中诱导的TAMs表型由M2型向M1型偏移。WB实验表明,23-HBA对巨噬细胞极化的调控机制可能与对信号轴JAK/STAT3/NF-kB/STAT 1 的影响有关,23-HBA能明显降低TAMs 的p-STAT3 蛋白表达,同时明显升高p-NF-kB蛋白表达,而对p-JAK1和p-JAK2表达无明显影响;分子对接结果也进一步显示23-HBA化合物与STAT3蛋白分子具有较好的结合活性。