番薯(Ipomoea batatas L.Lam.)具有高稳产、耐贫瘠等诸多优点,是世界上重要的粮食和能源作物,在国民经济生产中具有重要作用。番薯储藏根富含淀粉、可溶性糖、膳食纤维、蛋白质、维生素、矿物质等多种人体所需的重要元素,具有极高的营养价值。目前,番薯的研究主要集中在块根发育、栽培番薯的起源、花青素代谢、栽培技术改良、种质资源开发等方向。类黄酮作为植物中非常重要的代谢物,具有多种生物功能,但目前对于番薯中非花青素类黄酮的研究相对较少。根据前人对番薯类黄酮种类的研究,我们认为类黄酮3-O-糖基转移酶(Flavonoid 3-O-Glycosyltransferase,F3G)可能在番薯的类黄酮代谢中发挥重要的功能。而且,不少研究表明F3G在植物生长发育和抵抗非生物胁迫过程中,发挥着重要作用。所以我们采用体外酶活和体内过表达的方法对番薯的F3G展开研究。首先,选择模式植物拟南芥[Arabidopsis thaliana(L.)Heynh]的F3G(UGT78D2)作为参考基因,与番薯基因组进行比对,发现IbF3G1、IbF3G2、IbF3G3和IbF3G4同源性较高。进一步进行结构域分析,发现IbF3G1的PSPG(plant secondary product glycosyltransferase box)更加保守,采用NJ(Neighbor-Joining)法构建的系GSK1120212统发育进化树也表明IbF3G1在进化上也更加保守。对这4个基因进行原核表达并检测酶活,结果表明,在UDP-葡萄糖、UDP-木糖、UDP-鼠李糖和葡萄糖醛酸中,IBF3G1只选择UDP-葡萄糖作为糖基供体,催化槲皮素糖基化生成异槲皮素,而其他三个蛋白没有表现出催化槲皮素糖基化的功能。在山柰酚的催化反应中,这四个蛋白均未表现出糖基化活性。可以确定IbF3G1就是番薯中的F3G,并且经过纯化得到了较高纯度的IBF3G1。然后,将具有F3G功能的IbF3G1在野生型黄肉番薯(本实验室编号为P32)和拟南芥UGT78D2基因的突变体SALK＿049338中进行过表达试验。选择番薯的野生型株系(WT)和两个过表达株寻找更多系(IbOE1、IbOE2),拟南芥的野生型株系(WT)、突变体株系(Atugt)和两个过表达株系(AtOE1、AtOE2)进行后续的试验。在番薯中检测异槲皮素含量,发现IbOE1(9.45μg/g)和IbOE2(18.06μg/g)分别是WT(4.64μg/g)的2.03倍、3.89倍。同样的,在拟南芥中也检测了异槲皮素含量,WT(1.74μg/g)是Atugt(1.26μg/g)的1.24倍,AtOE1(2.83μg/g)和AtOE2(4.50μg/g)分别是Atugt(1.26μg/g)的2.56倍和3.59倍。这说明番薯中的IbF3G1基因可以在拟南芥中正常表达,并回补了部分突变体缺失的基因功能。为探究IbF3G1对类黄酮代谢的影响,检测了两种植物的总黄酮含量,在番薯中,IbOE1(20.70 mg/g)和IbOE2(32.66 mg/g)分别是WT(14.63mg/g)的1.41倍,2.32倍;在拟南芥中,WT(13.06 mg/g)、AtOE1(14.32 mg/g)和AtOE2(16.27 mg/g)分别是Atugt(8.34 mg/g)的1.72倍、1.56倍、1.95倍。为探究总黄酮含量变化的原因,对这两种植物类黄酮代谢通路的结构基因进行表达量的检测,发现转基因植株中CHI、CHS、FLS、F3H、ANS都有上调。其中FLS上调最显著,它在IbOE1和IbOE2的表达量分别是WT的2.08倍、8.07倍;在WT、AtOE1、AtOE2中的表达量分别是Atugt的1.37倍,4.65倍,8.14倍。这说明F3G(IbF3G1)在番薯和拟南芥中可能通过调控类黄酮代谢通路结构基因的表达来调节总黄酮的含量。用拟南芥对该基因抵抗非生物胁迫的能力进行探究。在正常MS培养基上的种子萌发率没有显著性差异(WT:98%,Atugt:99%,AtOE1:98%,AtOE2:99%);但是在100mM甘露醇的胁迫下,突变体的种子萌发率低于野生型和过表达株系(WT:93%,Atugt:85%,AtOE1:95%,AtOE2:95%);在150 mM甘露醇的胁迫下,萌发率整体要低于100 mM甘露醇处理组((WT:84%,Atugt:71%,AtOE1:85%,AtOE2:87%))。继续生长3天,对所有种子的成活率进行统计,在正常培养基上生长的拟南芥成活率和萌发率是一致的(WT:98%,Atugt:99%,AtOE1:98%,AtOE2:99%),而受到甘露醇胁迫之后的成活率整体都要低于萌发率,其中100 mM甘露醇处理组的成活率是(WT:81%,Atugt:69%,AtOE1:81%,AtOE2:83%),其中150 mM甘露醇处理组的成活率是(WT:73%,Atugt:60%,AtOE1:71%,AtOE2:71%)。土壤的干旱处理试验中(15天不浇水),突变体株系最先出现植株死亡,且生长态势弱于野生型株系和转基因株系;对离体叶片进行失水率检测,结果也表明转基因株系和野生型株系比突变体的失水率更低。检测了拟南芥的总抗氧化能力,在对照组中,WT、Atugt、AtOE1和AtOE2的抗氧化能力分别是31.78μmol/L、30.91μmol/L、33.01μmol/L、36.19μmol/L;在150 mM甘露醇处理组中,WT、Atugt、AtOE1和AtOE2的抗氧化能力分别是40.11μmol/L、38.24μmol/L、41.49μmol/L、43.59μmol/L。这表明野生型株系和转基因株系比突变体具有更强的抗氧化能力。对不同株系中过氧化氢含量进行检测,在对照组中,WT、Atugt、AtOE1和AtOE2的H_2O_2含量分别是0.75μmol/g、0.92μmol/g、0.75μmol/g、0.63μmol/g;在150 mM甘露醇处理组中,WT、Atugt、AtOE1和AtOE2的H_2O_2含量分别是3.12μmol/g、4.34μmol/g、2.45μmol/g、2.24μmol/g。转基因株系和野生型株系中的过氧化氢含量低于突变体,说明它们具有更强的活性氧清除能力。同时DAB染色的结果也表明,在甘露醇胁迫后,突变体含有更多的活性氧。最后,检测了非生物胁迫响应相关基因的表达量变化。在150mM甘露醇胁迫组中,野生型和转基因株系中这些基因的表达量均高于突变体,AtDREB1A在WT、AtOE1、AtOE2中的表达量分别是Atugt的1.84倍、2.45倍、9.80倍;at DREB1B在WT、AtOE1、AtOE2中的表达量分别是Atugt的2.20倍、4.42倍、4.85倍;AtRD29A在WT、AtOE1、AtOE2中的表达量分别是Atugt的1.37倍、3.45倍、4.51倍;AtRD29B在WT、AtOE1、AtOE2中的表达量分别是Atugt的1.49倍、1.78倍、2.91倍;AtKIN在WT、AtOE1、AtOE2中的表达量分别是Atugt的2.29倍、5.41倍、8.86倍;AtAREB1在WT、AtOE1、AtOE2中的表达量分别是AtugtEmergency disinfection的1.24倍、1.92倍、4.74倍。结果表明,受到干旱胁迫后,这些基因在转基因和野生型株系中的表达量比突变体要高。综上所述,本研究证明了番薯F3G(IbF3G1)基因催化槲皮素糖基化生成异槲皮素的功能,且发现IBF3G1具有糖供体和糖受体的选择特异性。利用番薯和拟南芥,对该基因参与的代谢调控网络进行了初步探索,发现该基因可以调节拟南芥的类黄酮代谢。而且,该基因可以调控非生物胁迫响应的相关基因,增强拟南芥抗氧化和抗旱能力。