研究背景膝骨性关节炎(knee osteoarthritis,KOA)是最常见的关节疾病,以功能障碍、疼痛、活动受限为主要临床表现。研究表明滑膜炎是影响KOA进程和疼痛的重要因素[1],抑制滑膜炎对抑制KOA患者疼痛的发展具有重要意义。针刺是临床治疗KOA常用且有效的补充替代疗法之一。国内外高质量RCT研究表明,针刺能够减轻KOA患者关节疼痛,改善膝关节功能,调节相关炎性因子含量。近年来发表于Nature等国际顶刊的针刺基础研究表明,针刺可通过激活自主神经(包括交感神经和副交感神经)发挥抗炎效应[4]。但针刺是否通过交感-免疫调节发挥抗炎效应缓解KOA炎性痛,还有待进一步研究。本研究拟以单碘乙酸钠(sodium monoiodoacetate,MIA)诱导的KOA模型大鼠为观察对象,结合痛行为学检测、免疫组织化学、ELISA、流式细胞术、蛋白质免疫印迹等技术,从痛行为学指标变化、全身和局部炎性因子含量变化、组织免疫细胞群变化、组织信号通路蛋白磷酸化水平变化、局部组织以及全身交感神经去甲肾上腺素能信号激活情况等方面研究电针“足三里”和“阳陵泉”穴对KOA模型大鼠的滑膜炎性反应的影响,探讨交感神经去甲肾上腺素能信号是否介导电针在KOA模型滑膜中发挥抗炎效应。本研究将为为临床应用电针缓解KOA疾病提供依据。研究目的(1)明确电针足三里-阳陵泉穴区对KOA模型大鼠疼痛行为的影响,并确定电针干预介入的时间点。(2)研究电针对KOA模型大鼠滑膜炎性反应的抗炎效应。(3)研究滑膜局部去甲肾上腺素能信号是否参与电针对KOA模型大鼠滑膜的抗炎效应。研究方法本实验研究主要分以下几部分:(1)观察电针对KOA模型大鼠自发痛和继发痛行为的影响将雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组、早期电针组和中期电针组。模型组、早期电针组和中期电针组组大鼠右膝关节腔予1mg/50μ L MIA溶液注射,建立KOA模型。对照组大鼠在同部位注射相同剂量生理盐水。造模成功后,给予电针组大鼠足三里-阳陵泉穴区电针干预,早期电针组在造模后1、2、3天进行干预,中期电针组在造模后5、7、9天进行干预。电针参数:1Hz/15 Hz,1mA,30 min/天。检测各组大鼠造模前后的基线痛行为学指标(患肢承重率和患肢足底机械缩足反射阈值)。(2)观察电针对KOA模型大鼠关节局部组织损伤和神经损伤的影响在第(1)部分实验结果的基础上,将相同条件的SD大鼠随机分为对照组、模型组和电针组。模型组和电针组大鼠的造模方法同上。电针组大鼠在造模后第5、7、9天给予电针干预。电针参数同上。对照组和模型组大鼠除不进行电针干预外,其余条件与电针组大鼠相同。观察造模后第9天滑膜组织形态检测(HE染色和Masson染色)、比较造模后第14天关节软骨损伤评分。(3)观察电针对KOA模型大鼠滑膜组织细胞因子含量的影响将雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组、早期电针组和中期电针组。模型组、早期电针组和中期电针组组大鼠右膝关节腔予1mg/50μ L MIA溶液注射,建立KOA模型。对照组大鼠在同部位注射相同剂量生理盐水。造模成功后,给予电针组大鼠足三里-阳陵泉穴区电针干预,早期电针组在造模后1、2、3天进行干预,中期电针组在造模后5、7、9天进行干预。电针参数:1Hz/15 Hz,1 mA,30min/天。检测早期电针干预实验中各组大鼠造模后第1天滑膜炎性因子含量和中期电针干预实验中各组大鼠造模后第9天滑膜炎性因子含量。炎性因子含量检BIBW2992测使用多因子检测(Multi-spot detecMetabolism抑制剂t,MSD)试剂盒,包括促炎细胞因子:肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-1β;抗炎细胞因子:IL-4、IL-10、IL-13、γ干扰素(Interferon gamma,IFN-γ);趋化因子:趋化因子CXC基序配体1(chemokine(C-X-C motif)ligand 1,CXCL1)。(4)观察电针对KOA模型大鼠滑膜局部肾上腺素能交感神经激活及其递质含量与受体表达的影响相同条件的SD大鼠随机分为对照组、模型组、电针组,造模方法同上。电针组大鼠干预方法同(2)。于造模后第9天电针两小时后,将大鼠处死,取血浆和患肢滑膜进行以下检测。①使用ELISA技术检测滑膜组织蛋白上清液和血浆中去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)含量;②通过蛋白质免疫印迹实验,检测滑膜组织中β 2肾上腺素能受体(beta 2 adrenergic receptor,β 2-AR)的表达水平;③采用免疫组织荧光染色技术,观察滑膜组织中多巴胺β羟化酶(Dopamine β hydroxylase,DBH)标记物的表达情况。(5)观察阻断交感神经去甲肾上腺素能信号对电针抗炎效应的影响将相同条件的SD大鼠随机分为对照组、模型组、电针组、6-OHDA+电针组和ICI118,551+电针组。造模方法同上。交感神经去甲肾上腺素能信号阻断:6-羟基多巴胺氢溴酸盐(6-Hydroxydopamine hydrobromide,6-OHDA)(150μg/50μl,溶解在含 0.02%抗坏血酸的生理盐水中)造模前一天注射至膝关节腔);或ICI 118,551(1.5μg/50μl,溶解在无菌生理盐水中)在每次电针前半小时注射到关节腔内。电针干预方法同(2)。于造模后第9天电针两小时后,检测各组大鼠患肢承重率。另一批大鼠于造模后第9天电针两小时后处死,检测滑膜组织蛋白上清液中促炎细胞因子TNF-α、IL-6、和趋化因子CXCL1的含量。(6)观察电针对KOA模型大鼠滑膜CXCL1/CXCR2轴活动影响将相同条件的SD大鼠随机分为对照组、模型组和电针组,造模方法同上。电针组大鼠干预方法同(2)。于造模后第9天电针两小时后,将大鼠处死,取血清和患肢滑膜进行以下检测。①通过蛋白质免疫印迹实验,检测滑膜组织中趋化因子(C-X-C基序)受体2(chemokine(C-X-C motif)receptor 2,CXCR2)的表达水平;②采用免疫组织荧光染色技术,观察滑膜组织中CD11b+免疫细胞标记物的表达情况,以及CD11b+的巨噬细胞上CXCR2的表达情况。(7)观察电针对KOA模型大鼠滑膜炎性反应及相关信号通路的影响将相同条件的SD大鼠随机分为对照组、模型组和电针组,造模方法同上。电针组大鼠干预方法同(2)。于造模后第9天电针两小时后,将大鼠处死,取血清和患肢滑膜进行以下检测。①将滑膜组织处理成单细胞悬液后,使用相应抗体染色并用流式细胞荧光分选技术检测滑膜CD11b+免疫细胞群和CD11b+CD86+M1型巨噬细胞群数量;②采用免疫组织荧光染色技术,观察滑膜组织中CD68+巨噬细胞标记物的表达情况,以及CD68+的巨噬细胞上IL-6的表达情况;③使用MSD试剂盒,检测血清中炎性因子含量;④通过蛋白质免疫印迹实验,检测滑膜组织中丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路代表分子ERK1/2和MEK的磷酸化水平。(8)电针对KOA模型大鼠后期隐神经结构的影响相同条件的SD大鼠随机分为对照组、模型组、电针组,造模方法同上。电针组大鼠干预方法同(2)。于造模后第14天后将大鼠处死,取患肢隐神经用透射电镜观察神经超微结构。研究结果(1)电针干预介入时间点的确定造模后第一天大鼠出现跛行症状,且进行性加重,提示造模成功。与模型组相比,早期电针组大鼠的患肢负重和患肢足底机械痛阈值在14天内都没有观察到改善,造模后第1天滑膜含量炎性因子无差异。而中期电针组大鼠在造模后第7、9、11天的患肢负重较模型组改善,提示中期电针改善KOA模型大鼠的自发痛。同时,中期电针组大鼠在造模后第14天的患肢足底机械痛阈值较模型组改善,提示中期电针改善KOA模型大鼠继发性触刺激诱发痛。(2)电针改善KOA模型大鼠关节局部病理损伤造模后第9天滑膜组织形态检测(HE染色和Masson染色)结果显示,模型组大鼠滑膜组织破坏明显、大量表层滑膜细胞迁移至内膜下层并出现明显的增生肥大,炎性细胞浸润情况明显,同时可见大量胶原纤维增生,提示滑膜纤维化。与模型组比较,电针组大鼠滑膜表面相对光滑,排列较为有序,细胞增生程度减轻,未见明显黏液样增生、炎性细胞浸润程度减轻,滑膜纤维化程度减轻。膝关节软骨损伤评分显示,造模后第14天,与对照组比较,模型组大鼠损伤评分升高(P<0.001);与模型组比较,电针组大鼠损伤评分降低(P<0.05)。(3)中期电针降低KOA模型大鼠局部滑膜促炎细胞因子含量MSD检测结果显示,与对照组比较,造模后第1天模型组大鼠滑膜组织TNF-α、IL-6、IL-1 β,CXCL1含量升高(P<0.01);与模型组比较,中期电针组大鼠滑膜组织中IL-6、CXCL1含量升高(P<0.01);与对照组比较,造模后第9天模型组大鼠滑膜组织TNF-α、IL-6、IL-1 β,CXCL1含量升高(P<0.01);与模型组比较,中期电针组大鼠滑膜组织中TNF-α、IL-6、IL-1β,CXCL1含量降低(P<0.05),而在血清中,各组大鼠的各项炎性因子含量都未观察到显著性差异。提示造模并未引起全身性炎性反应。(4)局部交感神经介导电针对KOA大鼠滑膜的抗炎效应。造模后第9天,与对conventional cytogenetic technique照组比较,模型组大鼠滑膜NE含量下降(P<0.01);与模型组比较,电针组大鼠滑膜NE含量上升(P<0.01)。而各组大鼠血浆中的NE含量没有显著性差异。同时,蛋白质免疫印迹实验结果显示,与对照组比较,模型组大鼠滑膜组织中β 2-AR表达水平降低(P<0.001),与模型组比较,电针组大鼠滑膜组织中β 2-AR表达水平升高(P<0.01)。免疫组织荧光染色结果显示,与模型组比较,电针组大鼠滑膜DBH表达增多。提示电针激活滑膜局部肾上腺素能交感神经,提高局部NE含量,激活滑膜免疫细胞上的β 2-AR。造模后第9天,与对照组比较,模型组大鼠患肢承重率下降(P<0.001),滑膜组织TNF-α、IL-6、CXCL1含量升高(P<0.01);与模型组比较,电针组大鼠患肢承重率上升(P<0.01),滑膜组织中TNF-α、IL-6、CXCL1含量降低(P<0.05)。与电针组比较,6-OHDA+电针组和ICI118,551+电针组大鼠患肢承重率降低(P<0.01),滑膜组织TNF-α、IL-6、CXCL1含量升高(P<0.05),电针对KOA模型大鼠疼痛缓解及抗炎效应效应受影响。提示滑膜局部交感神经去甲肾上腺素能信号介导电针的抗炎效应。(5)电针抑制CXCL1/CXCR2轴活动,调节滑膜巨噬细胞活动,缓解滑膜炎性反应双定量变量资料相关性分析结果提示滑膜中CXCL1含量和IL-6含量进行高度相关(n=90、r=0.6457、P<0.0001)。蛋白质免疫印迹实验结果显示,与对照组比较,模型组大鼠滑膜组织中CXCR2表达水平升高(P<0.01),与模型组比较,电针组大鼠滑膜组织中CXCR2表达水平降低(P<0.05)。免疫组织荧光染色结果显示,造模后滑膜组织中免疫细胞CD11b和CXCR2表达增多,与模型组比较,电针组大鼠CD11b和CXCR2表达减少。提示电针后KOA大鼠滑膜免疫细胞上CXCR2活动减少。造模后第9天,与对照组比较,模型组大鼠滑膜组织中CD11b+免疫细胞群和CD11b+CD86+M1型巨噬细胞群数量升高(P<0.001);与模型组比较,电针组大鼠滑膜组织中CD11b+免疫细胞群和CD11b+CD86+M1型巨噬细胞群数量减少(P<0.001)。免疫组织荧光染色结果显示,与对照组比较,模型组大鼠滑膜组织中巨噬细胞标记物CD68和M1型巨噬细胞分泌的IL-6表达增多;与模型组比较,电针组大鼠滑膜CD68和IL-6表达减少。电针后KOA大鼠滑膜巨噬细胞群及其功能活动(M1型极化和促炎细胞因子分泌)减少。蛋白质免疫印迹检测结果显示,与对照组比较,模型组大鼠滑膜组织MAPK信号通路代表分子ERK1/2(P<0.001)和MEK(P<0.001)的磷酸化水平升高,模型组比较,电针组大鼠滑膜组织中ERK1/2(P<0.05)和MEK(P<0.001)的磷酸化水平降低。以上结果提示,电针通过抑制CXCR2表达和MAPK信号通路,调节巨噬细胞功能缓解KOA模型大鼠滑膜炎性反应。(6)电针改善KOA大鼠疾病后期神经脱髓鞘情况模型组大鼠隐神经出现明显的髓鞘结构破坏,髓鞘板层崩解松散、挤压轴索或板层增厚并出现裂隙;与模型组比较,电针组大鼠隐神经损伤情况明显减轻。提示电针缓解KOA模型大鼠组织损伤和后期神经损伤。结论1.电针缓解KOA模型大鼠自发痛和触诱发痛,减轻关节局部病理损伤。2.电针激活KOA模型大鼠膝关节局部交感神经释放去甲肾上腺素,作用于β 2肾上腺素能受体,缓解滑膜局部炎性反应。3.滑膜局部交感神经去甲肾上腺素能信号介导电针对KOA模型大鼠滑膜的抗炎效应。