生物钟是一种内源性机制,使机体能够预测日常环境的变化,从而协调各种生理活动和行为节律,有利于个体更好的生存。生物节律对动物免疫反应以及生长发育繁殖具有重要影响。生物钟分子机制主要依赖于一 个细胞自主调控的转录/翻译反馈环路。该环路中CLOCK可与BMAL1在核中形成异二聚体,激活在其启动子和增强子区域含有E/E’-box元件的靶基因负调控因子如周期(Per)和隐花素(Cry)基因家族的转录。Per和Cry蛋白形成另一种异二聚体,然后转移到核中,并与CCCRG 81045使用方法LOCK:BMAL1复合物相互作用以抑制其转录激活,从而形成反馈环路。本研究利用CRISPR-Cas9技术成功构建clock1a纯合突变(clack1a-/-)斑马鱼品系,并与标记中性粒细胞的绿色荧光蛋白Tg(lyz:EGFP)品系斑马鱼杂交并获得带有绿色荧光蛋白标记中性粒细胞的clock1a纯合突变体。通过酶切鉴定、基因测序及qRT-PCR检测鉴定clock1a突变的有效性。在构建clock1a-/-斑马鱼的基础OIT oral immunotherapy上进一步研究了clockla-/-斑马鱼www.selleck.cn/products/liproxstatin-1的生长发育及行为活动状态和生理状态,发现clock1a-/-并未对斑马鱼幼鱼生长发育及形态产生显著影响;在对正常光周期和持续黑暗条件下斑马鱼幼鱼的昼夜行为节律的监测发现,clock1a-/-斑马鱼正常光周期下运动速率降低,持续黑暗条件下昼夜节律性运动消失;在研究clock1a-/-斑马鱼幼鱼下游钟基因表达水平的检测中发现,bmal1b、perIb、per2、cry1ba基因表达水平在正常光暗和持续黑暗条件下均发生显著改变。以上结果均表明clock1a-/-使斑马鱼失去了昼夜节律性。在此基础上我们进一步研究了clock1a-/-斑马鱼昼夜节律消失后对中性粒细胞迁移和细胞因子表达水平的影响。结果表明,在白天和夜晚,clock1a-/-均可以显著增加中性粒细胞向炎症部位的迁移,并且在该过程中,clock1a-/-促进细胞因子表达水平升高,与中性粒细胞迁移趋势相一致。以上结果说明,生物钟基因clock1a可调控中性粒细胞的迁移和细胞因子表达水平从而影响免疫应答反应。本研究我们利用CRISPR-Cas9技术成功构建生物钟基因clock1a纯合突变(clock1a-/-)斑马鱼品系,并且证明clock1a可调节中性粒细胞的迁移从而调控免疫反应,可以进一步认识生物钟在免疫反应过程中的角色,可以加深对该领域的认识,同时为动物机体生物钟紊乱相关疾病的治疗以及生物钟在家禽畜牧免疫抗病的研究提供理论参考。