生物合成阿克拉维酮关键基因的异源可溶性表达

阿克拉维酮(aklavinone)是合成蒽环抗癌药的中间体,具有极高的经济价值。由于其在原生产菌(Streptomyces galilaeus,S.peucetius)中难以高产,故选择适宜的宿主进行异源生物合成阿克拉维酮是可行路线。在诸多宿主中,大肠杆菌(Escherichia coli)由Dorsomorphin采购于其生长快速,产物易分离、基因操作手段丰富而成为异源表达宿主的首选。阿克拉维酮是II型聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)催化的产物,该类酶在大肠杆菌中通常以包涵体形式存在,因此在大肠杆菌中重构PKS系统具有挑战性。探究阿克拉维酮合成途径中关键酶基因的异源可溶性表达,可为在大肠杆菌中重构阿克拉维酮,甚至阿霉素和阿克拉霉素途径奠定基础。本文围绕生物合成阿克拉维酮的关键酶基因dpsA、dpsB、dpsC、dpsD以及dpsG的异源可溶性表达,进行了以下探究:1.通过降低表达温度、降低诱导剂浓度、更换表达菌株、引入分子伴侣蛋白、更换启动子等手段,尝试提高蛋白质Dps A、Dps B、Dps C和Dps D的溶解度。结果表明,温度、诱导剂浓度以及表达菌株不是蛋白质形成包涵体的主要原因;2.为寻找DpsG的修饰蛋白,使DpsG在大肠杆菌具有催化活性,串联表达dpsG以及holo-ACP合成酶基因acp S,通过蛋白纯化及SDS-PAGE分析可知,Acp S成功将DpsG激活;3.为研究基因偶联、蛋白融合以及基因串联表达对蛋白可溶性的影响,对dpsB和dpsC的表达载体重新设计,使其以4个核苷酸重叠的方式进行排列,让基因偶联转录;以柔性Linker连接dpsB和dpsC基因,使蛋白质融合;另外将dpsB、dpsC、dpsG和acp S进行串联表达,以保证ACP-KS-CLF复合体的完整性。结果显示,偶联转录和融合表达对Dps B和Dps C的可溶性表达无影响,min PKS的蛋白之间不存在互相促进折叠的关系;4Dynamic medical graph.基于Solubis和AGGRESCAN3D(A3D)对Dps A、Dps B、Dps C和Dps D进行蛋白质点突变设计,基于PROSS蛋白设计在线服务器对Dps C进行多位点突变,试图通过改造蛋白聚集区域提高蛋白质溶解度。其中由Solubis和A3D筛选出的突变位点并未明显提高蛋白质可溶性;而采用PROSS对Dps C的重新设计则极大提高了Dps C的溶解度。本文探究了降低蛋白质表达量、共表达分子伴侣BMS-354825使用方法、基因表达方式重新设计对蛋白质表达的影响;在上述实验的基础上,通过设计蛋白质点突变提高蛋白质溶解度,设计成功筛选出极具潜力的Dps C可溶性突变体,其在大肠杆菌内溶解度大大提升,这为阿克拉维酮合成途径在大肠杆菌中重构奠定了基础,也为其余II型聚酮合酶在大肠杆菌中的表达提供了方法。