研究背景皮肤角质类脂质体是一种由神经酰胺、胆固醇、棕榈酸、油酸和氢化磷脂组成的膜,其磷脂结构类似于体内细胞膜的脂质双层。皮肤角质类脂质体的内部空间不仅可以包封亲水性药物、还可以包裹疏水性药物。同时,它还具有毒性低,高生物相容性的特点。因此,皮肤角质类脂质通常用于药物递送系统。甘草黄酮是从甘草中提取分离出来的一种大类成分,具有抗氧化、抗溃疡、抗肿瘤、酪氨酸酶抑制等药理作用。但由于甘草黄酮不溶于水及各种油酯,只溶于乙醇、丙二醇、甘油及部分有机溶剂,导致其不能充分发挥相应的药理作用。将皮肤角质类脂体作为甘草黄酮的载体,可以提高甘草黄酮在皮肤局部的药物浓度,同时还延长甘草黄酮在皮肤局部的作用时间,这为皮肤疾病提供新的治疗方案。研究目的本论文以皮肤角质类脂体为载体分别将甘草查尔酮A和甘草黄酮制备成皮肤角质类脂体,以提高甘草查尔酮A、甘草黄酮在皮肤局部的滞留量,有利于药物在皮肤局部形成药物贮库,更好的发挥药理作用。同时,通过皮肤角质类脂体作用于大鼠皮肤,研究皮肤角质类脂体对皮肤角质层结构的影响,探讨皮肤角质类脂体促进药物渗透皮肤屏障的作用机制。通过大鼠皮肤局部以及血液中的药物浓度的检测,分析甘草黄酮皮肤角质类脂的代谢动力学。最后,通过体内、体外不同的试验,对甘草黄酮皮肤角质类脂体抑制酪氨酸酶的作用进行评价。研究方法1.甘草黄酮皮肤角质类脂体处方前研究采用高效液相色谱法(HPLC)建立测定甘草黄酮(指标性成分:甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、甘草查尔酮A)的含量方法;通过考察甘草黄酮的油水分配系数以及甘草黄酮在不同溶剂的溶解度,为后续实验的接收介质选择合适的溶剂。2.皮肤角质类脂体制备工艺研究通过考察甘草查尔酮A、甘草黄酮皮肤角质类脂体的处方配比以及制备工艺的条件,确定影响包封率的主要因素。采用星点设计-效SB431542溶解度应面法和Design-Expert 8.0软件,筛选最优处方与制备工艺。最后,采用透射电子显微镜和Mastersize 2000激光衍射粒度仪对甘草查尔酮A、甘草黄酮皮肤角质类脂体的形态特征进行考察。3.皮肤角质类脂体促渗透机制的研究采用Franz扩散池,以生理盐水(含30%PEG400)作为接收液,在离体大鼠皮肤上分别给予相同甘草黄酮含量的皮肤角质类脂体、甘草黄酮溶液,收集不同时间的渗透液,通过计算甘草黄酮的渗透速率,分析这2种剂型中甘草黄酮渗透离体大鼠皮肤的差异。在皮肤滞留量试验中,测定离体大鼠皮肤内甘草黄酮的含量,分析皮肤角质类脂体对甘草黄酮在皮肤内滞留量的影响。采用热差分析(DSC)和傅里叶红外光谱(FTIR)实验,研究皮肤角质类脂体对大鼠皮肤角质层结构的影响,分析角质层脂质与蛋白质的变化对药物进入皮肤的作用。通过香豆素6(C6)的细胞荧光定位以及离体大鼠皮肤的分布研究,考察皮肤角质类脂体在促进药物渗透细胞膜以及角质层过程中的作用。4.甘草黄酮皮肤角质类脂体药动学研究将甘草黄酮凝胶及甘草黄酮皮肤角质类脂体凝胶作用于大鼠皮肤,分别采用微透析技术和眼球静脉丛取血法对甘草黄酮在大鼠皮肤和大鼠体内的代谢动力学进行考察,并计算其相关药动学参数,分析不同剂型对甘草黄酮在大鼠体内代谢动力学的影响。5.甘草黄酮皮肤角质类脂体药效学评价在皮肤角质类脂体作用于小鼠黑色素瘤细胞(B16F10)后,通过对细胞活力的检测,评价甘草黄酮皮肤角质类脂体的细胞毒性;通过L-酪氨酸反应试验考察甘草黄酮对细胞内酪氨酸酶活性的影响;通过考察小鼠黑色素瘤细胞(B16F10)内以及大鼠皮肤黑色素含量的变化,阐述甘草黄酮皮肤角质类脂体对细胞内黑色素的影响。采用紫外线照射的方法对大鼠皮肤进行黑化造模,在大鼠皮肤造模部位给药治疗,通过蛋白组学技术分析各组大鼠皮肤内的蛋白含量差异,评价皮肤角质类脂体对皮肤角质层蛋白以及甘草黄酮对大鼠皮肤黑色素的影响。研究结果1.甘草黄酮皮肤角质类脂体处方前研究甘草黄酮含量测定方法的HPLC色谱条件为:Agilent 5 HT-C18柱(250 mm x4.6mm,5 μm),乙腈-甲醇-0.2%磷酸水梯度洗脱,流速:1.0 mL/min;柱温:30℃;进样量:10 μL;检测波长:230 nm。分别建立了以甲醇和含30%PEG400生理盐水为溶剂的标准曲线,且五个成分在浓度范围内与峰面积均呈现良好的线性关系。从溶解度实验结果发现,相对于其他的溶剂,在含30%PEG400的生理盐水中,甘草黄酮五个指标性成分都有较好的溶解性,因此选择生理盐水(含GPCR & G Protein抑制剂30%PEG400)作为透皮实验的接收液。油水分配系数是预测药物在水中或者混合液中的溶解度。在一定程度上,油水分配系数可以预测甘草黄酮其在皮肤上的渗透性能。甘草黄酮指标性成分的油水分配系数分别为:甘草苷0.804、异甘草苷1.411、甘草素1.298、异甘草素1.259、甘草查尔酮A1.970。油水分配系数实验结果表明,甘草黄酮的这五个成分的皮肤渗透性能较差,这说明甘草黄酮将不能在皮肤上很好的渗透,从而影响甘草黄酮在皮肤局部的治疗作用。2.皮肤角质类脂体制备工艺研究甘草查尔酮A皮肤角质类脂体(LAL):通过对影响包封率的因素进行分析,发现影响甘草查尔酮A皮肤角质类脂体包封率的主要因素是脂质比、醇水比以及神经酰胺用量、超声时间。以甘草查尔酮A的包封率为评价指标,利用Design-Expert 8.0软件对各个因素水平进行分析,得到最优处方条件分别为:卵磷脂0.025g、胆固醇0.025g、神经酰胺0.02g,溶于2 mL无水乙醇中,再分别加入0.125mg甘草查尔酮A,混匀,匀速加入10 mL预热65℃ PBS(pH 7.4),再慢速搅拌20 min(约700 rpm),65℃水浴保温50 min,100 W超声15 min,用0.45 μm过滤器过滤。该条件下制备的甘草查尔酮A皮肤角质类脂体的其包封率为 54.07±6.99%,平均粒径为 186.7±1.31 nm。甘草黄酮皮肤角质类脂体(LFL):通过对影响包封率的因素进行分析,发现影响甘草黄酮皮肤角质类脂体包封率的主要因素是药脂比、脂质比、醇水比以及神经酰胺用量。以甘草黄酮的包封率为评价指标,利用Design-Expert 8.0软件对主要因素水平进行分析,得到最优处方条件分别为:卵磷脂0.0250g、胆固醇0.0972g、甘草黄酮0.1402g,乙醇3mL,神经酰胺用量0.02 g。该条件下制备的甘草黄酮皮肤角质类脂体的其包封率为55.14±2.69%,平均粒径为211.8±2.26 nm。3.皮肤角质类脂体促渗透机制的研究在甘草黄酮的释放动力学分析中发现,甘草苷、异甘草苷、甘草素这三个成分从甘草黄酮(LF)和甘草黄酮皮肤角质类脂体(LFL)中的释放均符合零级动力学方程。本实验对LF和LFL进行对比,由结果可知,LFL组CMV infection中甘草苷、异甘草苷、甘草素三者的单位面积累积透过量都高于LF组,且以上三个成分在24 h内持续释放,皮肤渗透速率稳定;在LF中甘草苷的渗透速率为2.1973μg·h-1·cm-2,异甘草苷的渗透速率为0.5535 μg·h-1·cm-2,甘草素的渗透速率为0.2686 μg·h-1·cm-2;在LFL中甘草苷的渗透速率为3.5542μg·h·cm-2,异甘草苷的渗透速率为0.6010 μg·h-1·cm-2,甘草素的渗透速率为0.3509μg·h-1·cm-2。LF组中甘草黄酮指标性成分的渗透速率明显低于LFL组,这说明皮肤角质类脂体可以促进甘草黄酮渗透进入皮肤。此外,在甘草黄酮释放动力学实验中可以看出,甘草苷、甘草素以及异甘草苷可以通过扩展池渗透进入大鼠离体皮肤,而异甘草素和甘草查尔酮A并不能在接收液中被检出。虽然甘草查尔酮A在该批次甘草黄酮中的含量相对较高为4%,但可能是由于其化学结构导致其不能很好的渗透皮肤。而异甘草素其在甘草黄酮中的相对含量(0.05%)较低,在渗透液中的含量过低,超出检测限而不被检测出来。在LFL组和LF组中皮肤滞留量的分析结果可以看出,两组之间的皮肤滞留量具有显著性差异(P<0.05),而且LFL组的甘草黄酮皮肤滞留量均明显高于LF。这说明皮肤角质类脂体可以促进甘草黄酮进入皮肤。通过对大鼠皮肤样品的差示热扫描曲线分析,与空白对照组(CT)相比,空白皮肤角质类脂体组(NL)的大鼠皮肤其角蛋白相变温度升高。这说明在皮肤角质类脂体的作用下,大鼠皮肤角蛋白结构可能发生改变。LF组大鼠皮肤的熔点进一步升高,而LFL组中的熔点相对于NL组熔点减少的程度较低。NL组的角蛋白熔点低于LF组和LFL组。同时,研究结果显示不同处理组的皮肤焓值(相变温度)与对照组相比有不同程度的提高,焓值的变化程度:NL组>LFLG组和LFG组>NG组。熔点的降低说明皮肤的热稳定性变差。皮肤角质类脂体的加入降低了大鼠皮肤的热稳定性,这可能与角蛋白的结构改变有关。在傅里叶红外光谱(FTIR)中,皮肤样品的吸收峰主要为角质层脂质峰(Vas CH2,VsCH2)和角蛋白峰(Amide Ⅰ,Amide Ⅱ)。通过对大鼠皮肤样品的FTIR结果分析,NL组、CT组、LFL组、LF组、LA组以及LAL组大鼠皮肤的吸收峰面积与对照组相比有不同程度的增加。此外,与NL组的皮肤吸收峰面积相比,LAL组和LFL组的吸收峰面积增加程度更大。通过对皮肤角质类脂体在皮肤分布实验,发现在10～60 min的时间内,随着时间的推移,在香豆素皮肤角质类脂体凝胶(C6L)处理组的皮肤上,荧光强度越来越高,而且荧光密度逐渐增加。这说明随着时间的增加,皮肤角质类脂体可以促进药物在皮肤中的积累和扩散。给药50 min后,C6L组的皮肤上,可以清晰的观察到整个皮肤表皮层中都有荧光。相同给药时间后,C6溶液组的荧光值比C6L组低。这说明皮肤角质类脂体与皮肤有更好的结合能力,有利于药物扩散到皮肤中,从而发挥药理作用。在细胞定位实验中,发现香豆素C6荧光信号大量存在于细胞质中,其绿色荧光的信号与溶酶体染色剂Lyso-Tracker Red所形成的红色信号重叠,而不与细胞核染色剂DAPI的蓝色信号重叠。这说明,皮肤角质类脂体被吞噬后,存在于细胞质内。4.甘草黄酮皮肤角质类脂体药动学研究通过分别对LFG和LFLG在SD大鼠的皮肤背部组织液和血液中的浓度变化进行分析发现,LFLG组中各指标性成分的半衰期分别为:甘草苷16.74h、异甘草苷12.97h、甘草素11.55h、异甘草素70.95h,比LFG组的半衰期长。LFG组各指标成分的半衰期为:甘草苷6.03h、异甘草苷6.68h、甘草素5.67h、异甘草素42.22h。LFLG组中各指标性成分在皮肤中的浓度(甘草苷3.35μg/mL、异甘草苷2.85μg/mL、甘草素2.95μg/mL、异甘草素1.46μg/mL)都比LFG组的浓度(甘草苷3.18μg/mL、异甘草苷1.66μg/mL、甘草素2.85μg/mL、异甘草素0.93μg/mL)高。半衰期的延长,说明LFLG能够使药物皮肤中滞留更长时间,这可能是由于LFLG在皮肤角质层形成了药物贮库,缓慢地释放甘草黄酮。皮肤局部的药动学结果表明,LFLG组中甘草黄酮在真皮层中的浓度明显高于LFG组,这说明皮肤角质类脂体能够促进甘草黄酮渗透角质层进入皮肤中,提高药物在皮肤的浓度,进而影响其治疗作用。5.甘草黄酮皮肤角质类脂体药效学评价细胞毒性试验结果显示,当甘草黄酮的浓度高于0.45 mg/mL时,细胞活性的抑制率大于53.56%左右。而酪氨酸酶活性测定和黑色素含量测定结果显示,在一定范围内,随着甘草黄酮药物浓度的增加,酪氨酸酶活性呈现逐渐降低。大鼠皮肤蛋白组学分析结果,发现黑化后的模型组与空白组的差异蛋白所富集得到的通路为核糖体通路(Ribosome,rno03010)。而甘草黄酮皮肤角质类脂体组与模型组之间差异蛋白KEGG通路富集得到的通路为:军团菌通路(Legionellosis,rno05134)以及抗原加工与暴露相关通路。结论1.甘草黄酮皮肤角质类脂体处方前研究采用高效液相色谱建立甘草黄酮五个指标性成分含量的测定方法,其线性关系以及仪器精密度均为良好。甘草黄酮五个指标性成分在生理盐水(含30%PEG400)中均有较好的溶解度,可以将(含30%PEG400)用于体外透皮试验的接收液。在饱和水正辛醇体系中,甘草黄酮五个指标性成分的油水分配系数较差。2.皮肤角质类脂体制备工艺研究甘草查尔酮A、甘草黄酮皮肤角质类脂体制备工艺研究表明,采用单因素考察法结合星点设计-效应面法筛选甘草查尔酮A、甘草黄酮皮肤角质类脂体的处方和制备工艺是有效、可靠的。3.皮肤角质类脂体促渗透机制的研究透皮机制研究表明,大鼠皮肤在皮肤角质类脂体干预后,皮肤角质层发生的热力学行为改变,调节大鼠皮肤角质层脂质双分子层的排列及其流动,有利于促进药物渗透进入皮肤。4.甘草黄酮皮肤角质类脂体药动学研究相关药动学研究表明,皮肤角质类脂体能够有效提高甘草黄酮透过皮肤角质层的渗透速率,增加药物的皮肤滞留量,延长药物在皮肤局部的作用时间,提高药物的局部浓度,增强药物的治疗作用。5.甘草黄酮皮肤角质类脂体药效学评价药效学研究表明,皮肤角质类脂体能促进甘草黄酮进入皮肤,并延长其在皮肤表面的作用时间,从而增强甘草黄酮抑制酪氨酸酶的作用,进而减少黑色素的产生,降低色素的沉淀。