背景:帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)是常见的神经退行性疾病,多巴胺能神经元的慢性进行性丧失是其主要病理特征,且在黑质致密部中表现最为明显,临床上表现主要为震颤、肌强直等运动症状。现阶段研究认为,诱导PD发生的一个重要因素是氧化应激。其中,活性氧水平异常、抗氧化酶活性失衡等因素可导致神经元功能障碍和凋亡。因此,减轻氧化应激的干预措施可能会抑制多巴胺能神经元的退化并减缓PD的进程。目前临床上使用西药对PD的治疗存在着明显的局限性,而我国传统医学中经历长时间应用和推广的中药,具有巨大开发价值,是寻找和应用更有效防治PD药物的宝库。其中,木豆叶作为传统草药,其抗氧化、抗炎等药理活性已在民间广泛使用中得到验证,此外木豆叶总提取物还具有神经保护作用。目前有关木豆叶黄酮类化合物的研究较为缺乏,基于“肾脑同治”的思想,深入探究木豆叶黄酮类化合物,以寻找治疗PD的潜在药物。根据课题组前期的研究,球松素是生物类黄酮化合物,作为木豆叶的活性成分之一,其具有潜在的神经保护作用,然而,目前有关球松素在6-OHDA诱导的PD的药理作用和具体作用机制尚不明确,需要进一步研究。目的:本论文以经典的神经毒剂6-OHDA作为PD模型的诱导剂,通过斑马鱼和人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的PD模型对球松素的神经保护作用进行验证。随后进一步探索球松素在抗氧化方面保护神经元的潜在作用机制。方法:给予6-OHDA(250μM)诱导斑马鱼建立体内PD模型,通过酪氨酸羟化酶免疫荧光染色和行为学测试,验证球松素的神经保护作用,同时给予30μM Nomifensine处理作阳性对照;给予50μM的6-OHDA诱导具有多巴胺能神经元的SH-SY5Y细胞建立体外PD模型,给予不同浓度球松素(0,0.1,1,5,25,100,200μM)处理,通过RT-q PCR和Western Blot检测SH-SY5Y细胞凋亡信号通路中Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP以及Nrf2/ARE信号通路中Nrf2、HO-1、NQO1的表达水平,通过MTT法和LDH释放检测评估细胞的相对活性和毒性,通过荧光染色检测ROS、线粒体膜电位、Elexacaftor小鼠细胞早期凋亡率和Nrf2核易位情况,通过双荧光素酶报告实验检测ARE启动子的活性,通过ELISA检测DNA片段化,通过试剂盒检测细胞内MDA、GSH、GSSG、NAD~+、NADH、SOD和GSH-Px的水平;通过si RNA对SH-SY5Y细胞进行Nrf2基因沉默,通过Western Blot检测Nrf2-si RNA的沉默效率,通过检测Nrf2-KO SH-SY5Y细胞的ROS水平、细胞活力、LDH释放水平、细胞早期凋亡率、线粒体膜电位明确Nrf2的关键性神经保护作用,通过Western Blot检测AKT/ERK蛋白激酶抑制剂对Nrf2核内表达水平的影响,以及磷酸化和总AKT/ERK蛋白的表达tick endosymbionts水平,通过双荧光素酶报告实验检测ARE启动子的活性明确AKT/ERK蛋白激酶的影响,通过检测ROS水平、细胞活力和细胞早期凋亡率明确AKT和ERK的关键作用。结果:给予6-OHDA处理的斑马鱼,其TH阳性细胞数量和密度明显减少,其运动能力受损,平均游动距离显著下降,给予球松素或阳性对照药AM-2282Nomifensine干预后,斑马鱼的TH阳性细胞数量显著增加,运动能力显著恢复,平均移动距离显著增加。给予6-OHDA处理的SH-SY5Y细胞,其细胞相对活力显著下降,LDH释放量显著增加,早期凋亡率显著增加,线粒体膜电位显著下降,DNA片段化增加,促凋亡蛋白Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP表达水平显著增加,抗凋亡Bcl-2蛋白水平显著下降,ROS和MDA水平显著增加,GSH/GSSG比值、NAD~+/NADH比值、GSH-Px和SOD酶活性显著下降,给予球松素干预则逆转了上述结果,此外还显著增加了Nrf2的核易位和ARE启动子活性,以及显著增加了HO-1和NQO1的蛋白和m RNA表达水平。通过si RNA沉默细胞Nrf2的表达,成功构建Nrf2-KO SH-SY5Y细胞,给予6-OHDA处理后,其细胞相对存活率和线粒体膜电位显著下降,早期凋亡率、LDH释放量和ROS水平显著增加,而复加以球松素处理并未改善情况,球松素的保护作用被取消。球松素对给予AKT/ERK蛋白激酶抑制剂处理后的SH-SY5Y细胞没有神经保护作用,表现为,细胞活力下降,ROS水平增高,细胞早期凋亡率增加,Nrf2未发生核易位,ARE启动子未被激活。Western Blot的结果则表明6-OHDA降低了正常SH-SY5Y细胞磷酸化AKT和ERK的正常水平,而给予球松素干预可逆转该作用。结论:球松素改善6-OHDA诱导的斑马鱼多巴胺能神经元丢失和运动功能障碍;球松素减轻6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激和细胞凋亡,该作用通过激活Nrf2/ARE信号通路实现;AKT/ERK蛋白激酶参与球松素调控Nrf2信号分子的激活。