玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEA)作为世界范围内常见的霉菌毒素,可造成动物生殖系统、肝脏、肾脏及免疫系统等不同程度的毒性损伤。肾小管上皮细胞(TECs)是肾脏的重要构成部分,具有先天性免疫特性,能够对肾损伤信号发生免疫应答,产生并释放炎性细胞因子,参与炎症进展。为揭示ZEA的肾毒性及机制,本试验以SD大鼠和大鼠肾小管上皮细胞株(NRK-52E cells)为研究对象,在构建ZEA体内及体外中毒模型的基础上,利用Western BlEntinostat供应商ot、RT-PCR、ELISA、流式细胞术、Medical mediation免疫荧光等技术,探讨了 ZEA对大鼠肾小管上皮细胞炎性细胞因子表达的影响及ROS介导的AKT信号通路在其中的作用。1、ZEA致SD大鼠肾脏炎性损伤为探究ZEA对动物肾脏功能及炎症信号通路的影响,将12只3周龄雄性SD大鼠随机分为2组,连续14d灌胃40mg/kg·bw的ZEA以建立体内中毒模型。通过肾脏器指数及血清尿素氮、尿酸和肌酐等变化评价ZEA对肾功能的影响;检测肾脏组织中抗氧化酶活性和丙二醛含量变化评价ZEA对肾脏氧化损伤的影响;HE染色观察大鼠肾脏组织形态学变化;Western Blot检测肾组织AKT、NF-κB、IκB蛋白表达水平;RT-PCR检测炎性细胞因子mRNA的转录水平。结果显示,与对照组相比,ZEA染毒后大鼠肾脏脏器指数显著降低(P<0.0 1),血清尿素氮、尿酸和肌酐等水平显著增高(P<0.01),肾小管萎缩,肾小管上皮细胞排列紊乱并有脱落现象,间质出现炎性细胞浸润;ZEA可促进大鼠肾脏中AKT和NF-κB信号通路关键蛋白磷酸化的表达(P<0.05或PPR-171作用<0.01);ZEA可诱导大鼠肾脏中促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TGF-β1、MMP9的表达(P<0.05或P<0.01)。结果表明,ZEA可导致大鼠肾脏发生炎性损伤,诱导炎性细胞因子的表达,并激活AKT和NF-κB信号通路。2、ZEA对大鼠肾小管上皮细胞炎性细胞因子表达的影响为探究ZEA对大鼠肾小管上皮细胞炎性细胞因子及AKT和NF-κB信号通路的影响,以NRK-52E细胞为对象,用不同浓度ZEA(0、5、10、20μmol/L)处理NRK-52E细胞24 h,建立ZEA体外中毒模型。CCK-8法检测细胞活力;RT-PCR法检测炎性细胞因子的表达;ELISA法检测促炎细胞因子IL-1β、IL-6的分泌水平;Western Blot检测AKT和NF-κB信号通路关键蛋白的表达水平;免疫荧光法检测细胞中NF-κB蛋白的核转位情况。结果显示:(1)与对照组相比,ZEA呈浓度依赖性地降低了 NRK-52E细胞的活力(P<0.05或P<0.01),造成细胞形态损伤。(2)与对照组相比,ZEA可诱导NRK-52E细胞炎性细胞因子的表达(P<0.05或P<0.01),并促进IL-1β、IL-6的分泌(P<0.05或P<0.01)。(3)与对照组相比,ZEA呈剂量依赖性提高了 AKT、NF-κB、IκB蛋白的磷酸化水平(P<0.05或P<0.01),且ZEA能诱导NF-κB蛋白发生核转位,当ZEA染毒浓度为10 μmol/L时,细胞核内NF-κB蛋白表达极显著升高(P<0.01)。结果表明,ZEA会诱导NRK-52E细胞表达促炎细胞因子,上调AKT和NF-κB信号通路关键蛋白磷酸化水平,引起NF-κB蛋白的核转位。3、ROS介导的AKT信号通路在ZEA致大鼠肾小管上皮细胞炎性细胞因子表达中的作用为进一步阐明AKT信号通路与ROS之间的相互作用关系以及其在ZEA致大鼠肾小管上皮细胞中的作用,试验以NRK-52E细胞为对象。通过CCK-8法探究ZEA和LY294002的最佳联合处理浓度,建立AKT的细胞抑制模型;RT-PCR和ELISA法检测炎性细胞因子的表达与分泌水平;Western Blot检测细胞总蛋白AKT、NF-κB、IκB磷酸化水平;免疫荧光法检测NF-κB蛋白的核转位情况。另外,通过CCK-8法探究ZEA和NAC的最佳联合处理浓度,建立ROS的细胞抑制模型,利用流式细胞术和DCFH-DA探针法检测细胞ROS水平;Western Blot检测AKT信号通路蛋白表达;RT-PCR法检测炎性细胞因子的表达。结果显示:(1)与对照组相比,ZEA组细胞中促炎细胞因子的表达水平显著上升(P<0.05或P<0.01),AKT和NF-κB蛋白磷酸化水平极显著升高(P<0.01),NF-κB蛋白入核表达增多;与ZEA组相比,10μmol/L ZEA与10 μmol/L LY294002联合处理组细胞中促炎细胞因子的表达及分泌水平显著下降(P<0.05),AKT和NF-κB蛋白磷酸化水平显著降低(P<0.05或P<0.01),并抑制NF-κB蛋白核转位。(2)与对照组相比,ZEA能呈剂量依赖性增加NRK-52E细胞ROS水平,且当ZEA处理浓度为10 μmol/L时,细胞中ROS水平极显著升高(P<0.01);与ZEA组相比,10 μmol/L ZEA与100 μmol/L NAC联合处理组细胞ROS水平显著降低(P<0.05),促炎细胞因子的表达水平显著降低(P<0.05或P<0.01),细胞总蛋白AKT、NF-κB、IκB磷酸化水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。结果表明,ZEA可以通过ROS介导的AKT信号通路引起NRK-52E细胞NF-κB蛋白核转位,诱导下游炎性细胞因子的表达。综上所述,ZEA可诱导大鼠肾小管上皮细胞表达炎性细胞因子,呈现剂量依赖性,说明ZEA诱导的肾毒性与其造成的肾小管上皮细胞炎性损伤有关。ROS介导的AKT信号通路在ZEA致肾小管上皮细胞炎性细胞因子表达的过程中呈现正调控作用。