牛肠激酶轻链(enterokinase light chain,EKL)是一种高度专一性识别Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列的蛋白酶,它能够在Lys的C端水解多肽,在蛋白生产和生物工程领域具有广泛的应用价值。目前市售EKL价格昂贵,提取分离成本较高,且天然的牛肠激酶来源有限,致使其应用受到限制。基于此,本研究利用基因工程方法,通过体外重组表达及其表达条件的优化Immunotoxic assay,获得了EPZ-6438较高产量且具有酶活性的EKL,从而为其开发应用提供了技术支撑。1牛肠激酶轻链基因的原核表达及其酶活性分析通过替换pET-28a(+)载体上的核糖体结合位点来提高EKL蛋白表达量。首次将EKL基因上游的 RBS1 序列(5′-TTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGA-3′)替换成 RBS2 序列(5′-AAAGAGGAGAAA-3′),并构建了重组表达质粒 pET-28a(+)-RBS1-EKL-His 和pET-28a(+)-RBS2-EKL-His。酶切鉴定和测序正确后,将其分别转化感受态E.coli ArcticExpress(DE3)。经 IPTG 诱导,SDS-PselleckchemAGE 和 Western-blot 结果显示,融合蛋白RBS1-EKL-His和RBS2-EKL-His均主要以包涵体的形式表达,并且RBS2-EKL-His的表达量相对较高。将包涵体进行复性,并通过亲和层析柱纯化结果显示,与RBS1-EKL-His相比,RBS2-EKL-His的蛋白产量提高了 55.20%。酶学活性结果显示,两者均能够特异性切割含有(Asp)4-Lys序列的底物蛋白。综上表明,将RBS1替换为RBS2后,提高了具有酶活性的EKL的表达量。2牛肠激酶轻链基因的真核表达及其酶活性分析根据牛EKL基因序列设计并合成引物,PCR扩增EKL基因,并将其克隆至真核表达载体pPIC9K的相应位点,构建重组表达质粒pPIC9K-His-EKL。酶切鉴定和序列分析正确后,将其转化至组氨酸缺陷型毕赤酵母宿主菌GS115中。经筛选,PCR鉴定结果表明,His-EKL基因成功整合到毕赤酵母的染色体中。通过诱导条件的优化,确定His-EKL在毕赤酵母中表达的最佳发酵条件为:诱导温度30℃,培养基初始pH 5.0,甲醇浓度1%,诱导时间72 h。利用亲和层析柱进行纯化,SDS-PAGE和Western-blot结果显示,融合蛋白His-EKL在毕赤酵母中成功获得分泌性表达,His-EKL纯度为98%,并且具有酶活性。本研究通过在两种蛋白表达系统中获得了 EKL,相较于大肠杆菌原核表达系统,通过优化毕赤酵母发酵条件,可以获得较高表达量和酶活力的分泌型表达产物EKL,更有利于实验室的推广应用,为降低蛋白生产的成本提供了生物原料。