烟草(Nicotiana tabacum L.)是我国重要的以叶为收获产品的非粮食经济作物,烟叶成熟时淀粉积累可达40%。叶片中的淀粉合成涉及多种酶的协调作用。首先是ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGP)催化葡萄糖-1-磷酸(Glc-1P)生成的腺苷二磷酸葡萄糖(ADPG)作为合成淀粉的底物。然后由不同的淀粉合酶(SSs)催化ADP-葡萄糖的葡萄糖单元转移到葡聚糖链上形成α-1,4键。淀粉合酶大致可分为两大类,一类是合成直链淀粉的颗粒结合淀粉合酶(Granule-bound Starch Synthase,GBSS),另一类是含多个亚型的可溶性SSs参与支链淀粉的合成。淀粉分支酶(SBE)将可溶性SSs合成的葡聚糖短链通过α-1,6糖苷键连接到长链上,从而共同生成支链淀粉。而近年报道的蛋白质靶向淀粉(Protein Targeting to Starch,PTST),也参与直链淀粉的合成。PTST不仅能够帮助拟南芥中的GBSS定位到淀粉颗粒上,对大麦胚乳中的淀粉合成也至关重要。同时其同源基因也对拟南芥中淀粉颗粒的起始、数量及大小起决定性作用。淀粉的组成、直链淀粉与支链淀粉的比例、淀粉颗粒里的大小等都会影响淀粉降解率,而淀粉含量是影响烘烤特性的重要因素之一,淀粉是否充分降解及其水解后的糖类物质都会影响烟叶色泽、香气、吃味。除烟草中NtAGPase及NtGBSS1的过表达会使淀粉含量积累外,关于烟叶中的淀粉合成及调控并无其他过多报道。而GBSS、PTST这两个基因除了与直链淀粉合成相关,对淀粉颗粒大小及结构也有一定影响,这有可能会影响烟叶的品质。因此本研究以烟草红花大金元作为研究对象,筛选直链淀粉合成基因Granule Bound Starch Synthase(GBSS)和Protein Targeting to Starch(PTST),通过基因工程手段敲除NtGBSS和NtPTST,获得了相应的突变植株,对其淀粉含量、淀粉颗粒及与相关糖类物质进行了检测,探究了相关基因在烟叶淀粉合成中的作用。以下是本文的研究结果:1.NtGBSS、NtPTST基因的鉴定及表达特征分析为了鉴定烟草中直链淀粉合成基因,我们首先以已有文献报道的颗粒结合淀粉合酶和蛋白质靶向淀粉的氨基酸序列为查询种子序列,在烟草全基因组序列中比对,筛选出颗粒结合淀粉合酶和蛋白质靶向淀粉候选基因。基于序列相似性及功能域分析结果,我们在烟草红花大金元品种中共鉴定获得8个NtGBSS候选基因(NtGBSS1～NtGBSS8)及7个NtPTST候选基因(NtPTST1～NtPTST7)。对于NtGBSS基因家族而言,与其他物种构建进化树结果表明,NtGBSS基因与拟南芥、番茄及土豆的GBSSⅠ具有高度同源性。通过多序列比对发现NtGBSS基因含有多个GBSS功能结构的保守氨基酸位点:包括糖基转移酶5的ATP结合位点K(赖氨酸),G(甘氨酸),I(异亮氨酸),R(精氨酸),F(苯丙氨酸),A(丙氨酸),E(谷氨酸),以及具有GTB拓扑结构的糖基转移酶家族1的S(丝氨酸),V(缬氨酸),D(天冬氨酸)位点,这些活性位点主要发挥糖基转移酶功能。基因结构分析结果显示NtGBSS基因都含有多个外显子,在16～30之间,而且位于同一分支的基因其结构相似。组织表达谱分析表明除NtGBSS3在种子中不表达外,其他基因在各个组织中都表达,NtGBSS1、NtGBSS3、NtGBSS4、NtGBSS5在叶片中大量表达,NtGBSS6、NtGBSS7、NtGBSS8在种子和根中大量表达,NtGBSS2在种子中表达量最高。对于NtPTST基因而言,进化树结果表明,烟草NtPTST基因与拟南芥、番茄等植物对应基因具有较高的同源性。NtPTST4、NtPTST5与拟南芥的At PTST2进化关系较近。多序列比对发现其含有多个保守氨基酸位点:主要为N末端的AMP活化蛋白激酶结构域位点W(色氨酸),K(赖氨酸)购买GSI-IX,G(甘氨酸),N(天冬酰胺),这些活性位点是糖原结合位点,参与结合淀粉的过程。组织表达谱分析表明NtPTST1～NtPTST7在各个组织中都表达,其中NtPTST1、NtPTST3、NtPTST6、NtPTST7在种子和根中大量表达,NtPTST2在根中大量表达,NtPTST4在叶片中表达量最高,NtPTST5在茎中表达量相对较高。结合序列及表达特征分析结果,NtGBSS2、NtGBSS4及NtPTST4可能在烟草叶片直链淀粉的合成过程发挥着重要作用。2.NtGBSS、NtPTST的敲除植株制备通过PCR扩增,获得了NtGBSS2、NtGBSS4与NtPTST4这三个基因的完整CDS序列,然后通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建敲除载体,利用农杆菌介导的遗传转化获得了三个基因的突变株且均已获得纯合植株。对NtGBSS2、NtGBSS4及NtPTST4所得突变植株检测发现,突变形式以删除和插入为主。对突变后的基因编码的氨基酸序列进行了分析,结果表明NtGBSS2,NtGBSS4中缺失3的倍数碱基的突变类型的基因编码的氨基酸序列部分缺失。而其余突变形式都造成了NtGBSS2、NtGBSS4及NtPTST4这三个基因翻译的提前终止,且终止子的插入位于功能结构域之前。3.NtGBSS、NtPTST敲除烟草株系的相关性状指标检测选取旺长时期的突变体植株进行表型观察与相关物质含量检测。与野生型对照相比,NtGBSS、NtPTST敲除烟草的生长发育并没有受到影响。颗粒结合淀粉合酶(GBSS)活性检测发现,NtGBSS2-8的杂合植株酶活性显著降低56.79%,NtGBSS2的其余2株杂合植株和1株纯合植株的酶活性降低但差异不显著;NtGBSS4的2株杂合植株Nt点击此处GBSS4-3、NtGBSS4-10酶活性显著降低,分别降低了51.86%、49.47%,NtGBSS4-9的纯合植株酶活性显著降低,减少了55.12%,NtGBSS4-6与野生型比较没有显著差异。而NtPTST4的突变植株的颗粒结合淀粉合酶活性均降低但差异不显著,这可能是由于PTST基因是介导GBSS基因靶向淀粉,其发生编辑并不直接影响GBSS酶活性。直链淀粉含量检测显示,NtGBSS2的4株突变株的直链淀粉含量都显著下降,分别降低了约28.3%、50%、50%和30%,且NtGBSS2-6、NtGBSS2-8、NtGBSS2-9呈极显著降低;NtGBSS4的4株突变株直链淀粉含量分别显著下降50previous HBV infection%、30%、40%、38%;NtPTST4突变株中无论是纯合体还是嵌合体植株,它们的直链淀粉都极显著降低,下降率在26.6%-58%之间。三个基因突变株直链淀粉含量显著或极显著下降,其下降率与不同基因的编辑形式和编辑效率相关。而突变体植株的支链淀粉含量在不同突变株中呈现升高或不变的趋势,NtGBSS2-5、NtGBSS2-9,NtGBSS4的4株突变植株和NtPTST4-4、NtPTST4-6、NtPTST4-8的支链淀粉显著升高外,其他突变株无显著差异。与野生型对比,NtGBSS2-5、NtGBSS2-6、NtGBSS2-8、NtGBSS2-9的敲除植株的总淀粉含量都显著降低,分别降低了24.43%、35.45%、47.86%、27.04%;NtPTST4敲除植株的总淀粉含量显著降低,减少量分别为33.97%、30.9%、19.04%、29.02%、12.21%、27.9%、26.17%;而NtGBSS4突变株总淀粉含量与野生型差异不显著,我们猜测这可能与直链和支链淀粉改变的比例有关,但其中具体的关系还需后续进一步研究。纯化叶片中的淀粉颗粒并用扫描电镜观察发现,NtGBSS2、NtPTST4突变植株的淀粉颗粒大小具有显著差异,作为对照的两株野生型淀粉颗粒大小都在3μm以下,其中小于1μm的分别占7.25%和10.6%,1-2μm之间占比最多,分别占81.16%和76.52%,剩余11.59%和12.88%在2-3μm之间。与之相比,NtGBSS2突变株中淀粉颗粒显著增大,4株突变株仅有2.46%-4.46%的淀粉颗粒小于1μm;大部分在2-3μm之间,不同突变株中占41.98%-55.22%;部分颗粒直径3-4μm,占7%-18.6%;而在NtGBSS2-5、NtGBSS2-6、NtGBSS2-8的突变株中其淀粉颗粒有超过1.23%的粒径大于4μm。NtPTST4突变株淀粉颗粒的粒径大小极显著增加。除NtPTST4-8以外,其余突变株小于1μm的淀粉颗粒处于0.8%-6.6%之间;大部分淀粉颗粒大小在2-3μm之间,占比达33.97%以上;所有突变株中有超过3.87%的淀粉颗粒大小大于3μm,而NtPTST4-3、NtPTST4-4、NtPTST4-5、NtPTST4-7突变株大于3μm的淀粉颗粒数超过10%。突变植株大颗粒淀粉数量占比要显著大于野生型,且淀粉颗粒更为圆润,而NtGBSS4突变植株的淀粉颗粒大小、结构与野生型差异不显著,NtGBSS4的淀粉颗粒整体上与野生型相似,1-2μm之间占比最多,占65.91%-74.38%;4株突变株小于1μm的淀粉颗粒占比要多于野生型,有6.82%-25.93%;其中NtGBSS4-6、NtGBSS4-9、NtGBSS4-10分别有0.62%、0.75%、2.27%的淀粉颗粒大小超过3μm。对影响烟叶品质糖类物质进行了测定发现,NtGBSS2、NtGBSS4及NtPTST4的突变植株还原糖、葡萄糖含量显著升高,更有利于其与氨基化合物发生Maillard反应。综上所述,本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了NtGBSS2、NtGBSS4和NtPTST4基因的突变体植株。实验结果表明NtGBSS、NtPTST参与烟草叶片中的直链淀粉合成,并对改变淀粉颗粒的大小和结构有一定作用,且能影响叶片中还原糖、葡萄糖的含量。研究工作为全面了解茄科植物淀粉的合成及调控机制奠定了基础,也为通过基因工程手段提升烟叶品质提供了新的视角。