目的:研究炙甘草汤是否可以通过介导ZBP1抑制心肌成纤维细胞程序性坏死,从而减轻心肌纤维化。方法:动物实验:C57BL/6小鼠随机分配到五个组:对照组(Control组)、模型组(Model组)(ISO)以及炙甘草汤高剂量组(ZhiGanCao Decoction High Dose)(ISO+ZGCD HD)、炙甘草汤中剂量组(ZhiGanCao Decoction Medium Dose)(ISO+ZGCDMD)、炙甘草汤低剂量组(ZhiGanCao Decoction Low Dose)(ISO+ZGCD LD)。在完成了对小鼠的模型构建及使用不同浓度炙甘草汤的处理后,采纳超声心动图技术,对各实验组小鼠的心功能进行了评估。为量化小鼠心肌纤维化的进展,我们比较了各组在HE染色、Masson染色及Sirius Red染色下心肌组织的病理特征。此外,利用免疫组织化学技术(IHC)分析了心肌组织中ZBP1、RIP1、RIP3、MLKL、α-SMA及COL-1蛋白的表达模式。同时,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)方法,测定了上述蛋白对应的mRNA在心肌组织中的表达水平。通过蛋白质印迹分析(WB),检测心肌组织里ZBP1、RIP1、RIP3、MLKL、α-SMA及COL-1蛋白表达水平。最后,ELISA法检测血清IL-1β、IL-6浓度。细胞实验:CCK8法检测用不同浓度炙甘草汤灌胃小鼠制备的含药血清对心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)增殖的影响。按照Control组、脂多糖(LPS)诱导组、LPS+ZGCD组、LPS+ADAR1组。使用LPS刺激CFs炎症反应诱导程序性坏死模型。用WB法检测心肌细胞中ZBP1、RIP1、RIP3、MLKL及α-SMA、COL-1蛋白表达状况。ELISA法检测CFs上清液IL-1β、IL-6浓度。实验结果:1.动物实验:通过超声心动图检测的心功能指标发现分组之间的差异:与Control组相比,Model组小鼠在左心室射血分数(LVEF)和左心室短轴缩短率(LVFS)这两个关键参数上均呈现明显降低趋势,左心室舒张末期内径(LVIDd)和左心室收缩末期内径(LVIDs)则明显上升,提示纤维化小鼠造模成功,心功能下降。经过分析,这些差异具有统计学意义(P<0.001,P<0.01);与Model组对比,使用ZGCD干预后小鼠心功能有所改善,LVEF、LVFS均表现出一定程度的恢复,而LVIDd和LVIDs也有所降低,并表现出一定的药物浓度依赖性。小鼠HWI(HW/BW)结果提示,与Control组对比,Model组的小鼠的HWI明显升高,给予ZGCD干预后明显降低,表明ZGCD在一定程度上可以降低心肌纤维化小鼠的心脏重量的Berzosertib IC50增加。经过分析,这些差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。HE染色、Masson染色、Sirselleck产品ius Red染色实验结果提示:在光镜下心肌组织切片,Control组的心肌细胞体积、大小适中,排列整齐紧密有序。Model组则形态异常、体积增大,胶原纤维、细胞间质增多。分析这些差异具有统计学意义(P<0.001)。ZGCD干预后心肌细胞的形态学特征较Model组有明显改善,显示出一定程度的修复趋势,恢复程度与用药浓度存在一定的依赖性,同时胶原沉积也存在相应的减少,经过统计分析,这些差异是有意义的(P<0.01,P<0.05)IHC结果显示,各Control组的心肌细胞呈现微量的棕黄色胶原纤维组织,Model组的胶原纤维组织较Control组明显增多,细胞程序性坏死相关分子ZBP1、RIP1、RIP3、MLKL以及纤维化标志物COL-1、α-SMA的蛋白阳性表达面积增多,经过分析,这些差异具有统计学意义(P<0.001);使用ZGCD干预后,胶原纤维组织较Model组显著减少,减少程度跟用药浓度存在一定的相关性,ZBP1、RIP1、RIP3、MLKL以及COL-1、α-SMA的蛋白阳性表达面积减少,经过分析,这些差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。WB 法检测相关蛋白结果示:Model 组的 ZBP1、RIP1、RIP3、MLKL、Col-1、α-SMA蛋白的表达水平均较Control组显著上升,经过分析,这些差异具有统计学意义(P<0.001,P<0.01)。相较于Model组,给予ZGCD干预后的的相关蛋白Col-1、α-SMA、ZBP1、RIP1、RIP3、MLKL的表达水平呈下降趋势,下降趋势跟用药浓度存在一定的依赖性,经过分析,这些差异具有统计学意义(P<0.01,PImmune contexture<0.05)。qRT-PCR法检测结果提示:Model组的目标基因在转录水平上的表达量较Control组明显升高,在mRNA定量分析ZBP1、RIP1、RIP3、MLKL、Col-1、α-SMA的表达均显著高于Control组,经过分析,这些差异具有统计学意义(P<0.001)。而跟Model组相比,给予ZGCD干预的组中ZBP1、RIP1、RIP3、MLKL及Col-1、α-SMA在mRNA层面的表达水平均有不同程度降低,且降低程度对用药浓度有一定的依赖性,经过分析,这些差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。ELISA法检测血清IL-1 β、IL-6浓度结果提示:相较于Control组,Model组小鼠血清中炎症细胞因子IL-1β、IL-6的表达水平都显著提升,经过分析,这些差异具有统计学意义(P<0.001)。相较于Model组,给予ZGCD干预后的小鼠血清中的炎症细胞因子IL-1β、IL-6表达水平明显呈下降,对用药浓度呈现出一定的依赖性,经过分析,这些差异具有统计学意义(P<0.001,P<0.01)。2.细胞实验:CCK8检测结果显示,使用不同浓度ZGCD灌胃小鼠制备的含药血清干预CFs细胞,细胞的增殖能力未见明显变化,证实炙甘草汤灌胃浓度在5-20 g/kg/天小鼠制备的含药血清,对CFs细胞无毒性药理作用。WB 结果显示:相较于 Control 组,LPS 组 ZBP1、RIP1、RIP3、MLKL、Col-1、α-SMA的表达水平均显著上升,经过统计分析,这些差异是有意义的(P<0.001)。相较于Model组,使用 ZGCD、ADAR1(ZBP1 抑制剂)干预后,各组中 ZBP1、RIP1、RIP3、MLKL、Col-1、α-SMA的蛋白表达水平明显呈下降趋势,经过统计分析,这些差异是有意义的(P<0.01,P<0.05)。ELISA法检测CFs上清液IL-1β、IL-6浓度结果提示:相较于Control组,LPS组CFs上清液中炎症细胞因子IL-1β、IL-6的表达水平均提升,经过统计分析,这些差异是有意义的(P<0.001)。相较于Model组,LPS+ZGCD、LPS+ADAR1组的CFs上清液中的炎症细胞因子IL-1β、IL-6表达水平明显呈下降趋势,经过统计分析,这些差异是有意义的(P<0.01)。结论炙甘草汤具有调控作用,能通过介导ZBP1来抑制心肌成纤维细胞的程序性坏死过程。减少心肌纤维化小鼠心肌组织内胶原纤维的异常积聚,有效减轻炎症反应,进而缓解心肌纤维化。