【研究背景】经皮冠状动脉介入治疗术(percutaneous coronary intervention,PCI)是目前全球范围内应用最广泛的心肌再灌注疗法,可有效提高冠心病和心肌梗死患者的生存率,改善患者的生存质量。然而,PCI术后由于支架内新生的内膜逐渐增厚演变为新生动脉粥样硬化斑块,导致支架内再狭窄(in-stent restenosis,ISR),甚至可破裂进展为急性心血管不良事件,严重影响患者预后。目前临床上使用的支架涂层药物较为缺乏,仅有紫杉醇(paclitaxel)和雷帕霉素(西罗莫司,rapamycin或sirolimus)及其衍生物等,这些药物存在着内皮愈合延迟,支架内血栓形成增加等问题,严重影响治疗效果。因此,寻找疗效肯定、不良反应较少的抗ISR支架涂层药物是十分必要和迫切的项目组前期研究发现,源于云南特色药用植物灯盏花的活性成分-灯盏乙素(Scutellarin)可保护血管内皮细胞,同时在动物血栓模型中有显著的抗血栓作用和较强的抗血小板聚集作用,提示灯盏乙素具有潜在的抗ISR作用。动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是PCI术的重要的病理基础,要明确灯盏乙素对PCI术后ISR的治疗作用,就必须关注灯盏乙素对AS的疗效。本论文首先复制APOE~(-/-)小鼠实验性动脉粥样硬化模型,从整体水平评估灯盏乙素防治AS的作用。接下来,构建AS小型猪冠状动脉支架模型,从整体水平评估灯盏乙素涂层支架抑制PCI术后ISR的作用。进一步地,从与ISR密切相关的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的角度,复制H_2O_2损伤VSMCs模型,观察灯盏乙素对VSMCs增殖、迁移、凋亡,表型转化及氧化应激的影响。为了明确灯盏乙素抗ISR的潜在作用机制,应用转录组学测序及分子对接技术探索灯盏乙素抑制PCI术后ISR的信号通路及关键靶点。在分子水平验证灯盏乙素对PI3K/AKT/m TOR及IKKs/NF-κB通路关键因子的交互调控作用,以期从整体、细胞和分子水平系统阐述灯盏乙素治疗ISR的作用机制。【目的】研究灯盏乙素抑制PCI术后支架内再狭窄的作用及分子机制。【方法】1灯盏乙素对APOE~(-/-)小鼠AS的治疗作用研究复制APOE~(-/-)小鼠实验性动脉粥样硬化模型。1.1组织病理学观察:分别使用大体油红O染色,HE染色、冰冻油红O染色、Masson染色对主动脉组织进行病理学检查,评价灯盏乙素对主动脉斑块组织病变程度、脂质沉积、胶原纤维增生程度的影响。1.2透射电镜检查:不同剂量的灯盏乙素治疗后对APOE~(-/-)小鼠主动脉微观结构改变的影响。1.3酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测灯盏乙素对APOE~(-/-)小鼠血清中TNF-α,IL-1β的影响。1.4免疫荧光检测不同剂量灯盏乙素对小鼠主动脉血管组织平滑肌细胞表型转换标志物SM22α,α-SMA和OPN蛋白表达的影响。1.5 Western blot检测灯盏乙素对小鼠主动脉血管组织平滑肌细胞表inflamed tumor型转换标志物SM22α,α-SMA和OPN蛋白表达的影响。1.6 Western Blot检测灯盏乙素对小鼠主动脉血管组织Bax,Bcl-2,Cleaved-caspase-3的蛋白表达的影响。1.7试剂盒检测各组小鼠血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性,丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,检测一氧化氮(nitric oxide,NO),还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH),谷胱甘肽过氧化酶(glutathione peroxidase,GSH-PX),过氧化氢(H_2O_2)的含量。1.8用二氢乙锭(Dihydroethidium Staining,DHE)荧光探针测定各组小鼠主动脉组织匀浆内的ROS的含量。2灯盏乙素涂层支架抑制PCI术后再狭窄作用研究2.1构建AS小型猪冠脉支架模型,将不同剂量的灯盏乙素涂层在支架表面,以雷帕霉素涂层(SES)支架为阳性对照组。实验动物全麻后于实验当天和28天均行冠状动脉定量造影(quantitative coronary angiography,QCA)和光学相干断层扫描(Optical coherence tomography,OCT),观察记录ISR相关的参数。2.2 AS小型猪支架植入术后28天处死取动物,取支架段血管标本行HE染色,在光学显微镜下评估支架植入段血管的损伤积分、炎症积分及血管内皮化积分,评估灯盏乙素涂层支架抗ISR的安全性和有效性,探讨灯盏乙素作为冠状动脉支架涂层药物的可能性。3灯盏乙素对VSMCs增殖、迁移、凋亡,表型转换及氧化应激的影响体外培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞(A7r5),复制H_2O_2损伤模型。3.1采用CCK-8法检测灯盏乙素对VSMCs增殖的影响。3.2划痕法检测灯盏乙素对VSMCs迁移的影响。3.3流式细胞术检测灯盏乙素对VSMCs细胞周期的影响。3.4免疫荧光法检测灯盏乙素对VSMCs表型转换标志物SM22α,α-SMA和OPN蛋白表达的影响。3.5 Western blot检测灯盏乙素对VSMCs表型转换标志物SM22α,α-SMA和OPN蛋白表达的影响。3.6荧光探针检测单个细胞及线粒体内ROS的荧光强度。3.7试剂盒检测Total SOD,Mn SOD,MDA,NADPH氧化酶的活性。4转录组学测序及分子对接技术预测灯盏乙素抗ISR的潜在作用靶点及通路4.1 Apo E~(-/-)小鼠主动脉血管组织的转录组学测序根据文库数据的产出及有效浓度需求合并,进行Illumina PE150测序。将clean reads比对到转录组数据,采用Hisat2软件对RNA-Seq测序数据进行比对分析。4.2使用Discovery Studio软件进行分子对接,通过对灯盏乙素抗AS的靶点、通路进行数据挖掘,为后续实验研究提供实验依据。5灯盏乙素对PI3K/AKT/m TOR及IKKs/NF-κB信号通路的调控作用研究5.1 Western blot方法检测PI3K/AKT/m TOR通路相关蛋白的表达及其磷酸化后蛋白的改变。5.2 AKT1抑制剂MK2206(20μmol/L)处理后,观察灯盏乙素对PI3K/AKT/m TOR通路的调控作用;检测灯盏乙素对平滑肌细胞的表型转换和细胞凋亡的影响。5.3 NF-κB抑制剂BAY11-7082(2μmol/L)预处理后,观察灯盏乙素对PI3K/AKT/IKKs/NF-κB信号通路的影响;检测灯盏乙素对平滑肌细胞表型转换的影响。【结果】1灯盏乙素通过抗炎、抗氧化、促进平滑肌细胞凋亡及调控其表型转换治疗AS1.1组织病理学检测结果:大体油红O染色,HE染色、油红O染色、Masson染色结果提示,灯盏乙素能明显减少主动脉斑块组织脂质沉积,减轻炎症反应,抑制斑块组织胶原增生,减轻Apo E~(-/-)小鼠AS模型主动脉血管组织病变程度和血管损伤。1.2透射电镜结果:正常组小鼠血管内膜完整,内皮间隙较小。模型组小鼠可见内皮细胞脱落,甚至消失,内皮上附着大量血浆无定形成分。灯盏乙素干预后,血管内膜损伤程度明显减轻,内皮结构趋于完整,偶有线粒体水肿与脂质泡沉积。1.3 ELISA检测结果显示:灯盏乙素能明显降低APOE~(-/-)小鼠AS模型血清TNF-α、IL-1β的含量。1.4免疫荧光结果显示:灯盏乙素能上调小鼠主动脉血管组织中平滑肌细胞收缩型标志物(α-SMA和SM22-α)表达,下调合成型标志物(osteopontin,OPN)表达。1.5 Western blot结果显示:灯盏乙素能上调小鼠主动脉血管组织平滑肌细胞收缩型标志物(α-SMA和SM22-α)的蛋白表达,下调合成型标志物(OPN)的蛋白表达。1.6氧化应激检测结果显示:灯盏乙素明显升高Apo E~(-/-)小鼠AS模型血清SOD,GSH-PX,NO水平,降低血清MDA和H_2O_2的含量。1.7 DHE染色结果显示:灯盏乙素能降低APOE~(-/-)小鼠主动脉组织匀浆内的ROS的含量。2灯盏乙素涂层支架明显抑制小型猪PCI术后的ISR2.1 QCA结果提示:灯盏乙素中、高剂量涂层支架组可有效抑制AS小型猪支架模型冠状动脉内膜增生,血管狭窄程度明显低于裸金属支架组(P<0.05)。2.2 OCT结果提示:和裸金属支架组相比,灯盏乙素中、高剂量涂层支架组冠状动脉新生内膜面积及狭窄程度均减小(P<0.05),且灯盏乙素高剂量涂层支架组和阳性药物组残余管腔面积,均明显大于其他实验组(P<0.05)。同时监测到裸金属支架组、灯盏乙素低、中剂量组均见不同程度冠状动脉内膜增生,管腔缩小。2.3 HE染色显示:在支架植入后28天,和裸金属支架组相比,灯盏乙素涂层支架以剂量依赖性的方式显著降低冠状动脉新生内膜厚度、新生内膜面积和血管再狭窄程度,具有差异(P<0.05)。和裸金属支架组相比,灯盏乙素可降低支架周围的炎症积分(P<0.05)。3灯盏乙素通过抗氧化调控VSMCs的表型转换抑制VSMCs的增殖、迁移3.1 CCK-8法结果显示:灯盏乙素能明显抑制VSMCs的异常增殖。3.2划痕法结果提示:灯盏乙素明显抑制VSMCs迁移。3.3流式细胞术结果显示:灯盏乙素能明显将VSMCs阻滞于G0/G1期。3.4氧化应激检测结果显示:灯盏乙素明显升高VSMCs中SOD,NO,降低MDA水平和NADPH氧化酶的活性。3.5细胞荧光探针结果显示:灯盏乙素明显升高VSMCs的SOD和Mn-SOD活性。4转录组学结果4.1转录组学结果显示:与正常对照组相比,模型组有1895个差异表达基因上调,2174个差异基因下调;与模型组相比,灯盏乙素组有531个差异基因上调,574个基因下调。当三组的差异基因取交集时时,总共有81个差异基因的重叠。GO生物学富集分析发现其主要涉及细胞迁移的正向调控、伤口愈合的正向调节、细胞对转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)刺激的反应等。KEGG结果分析表明,排名靠前的信号通路为:癌症通路、血小板激活通路、白细胞跨内皮的迁移通路,PI3K/AKT信号通路,TNF-α信号通路等,这些通路均参与灯盏乙素对AS的调控,其中PI3K/AKT/m TOR信号通路显著富集。4.2分子对接结果显示:灯盏乙素与AKT,SM22α,α-SMA,OPN,NF-κB具有强结合力,结合能分别为-6.72,-8.07,-8.61,-7.93,-7.72 kal/mol,可作为灯盏乙素抗ISR的潜在研究靶标。5灯盏乙素对PI3K/AKT/m TOR及IKKs/NF-κB通路的调控作用研究5.1 APOE~(-/-)小鼠主动脉血管组织PI3K/AKT/m TOR通路表达检测Western blot结果显示,与正常组比较,模型组p-PI3K,p-AKT,p-m TOR表达显著升高(P<0.01)。与模型组比较,灯盏乙素(14,28 mg/kg)组p-PI3K,p-AKT,p-m TOR表达降低(P<0.05)。5.2 H_2O_2损伤VSMCs模型PI3K/AKT/m TOR通路表达检测Western blot结果显示,与正常对照组相比,模型组p-PI3K,p-AKT,p-m TOR表达显著升高(P<0.01)。与模型组相比,灯盏乙素(50,100μmol/L)组p-PI3K,p-AKT,p-m TOR蛋白表达降低(P<0.05)。5.3抑制剂MK2206处理实验结果与正常对照组相比,模型组p-PI3K,p-AKT,p-m TOR,OPN,Bcl-2的表达显著升高,而SM22α,α-SMA,Bax,Cleaved Caspase-3的表达降低(P<0.05)。与模型组相比,模型+MK2206组,模型+Scutellarin(100μmol/L)组的p-PI3K,p-AKT,p-m TOR,OPN,Bcl-2的表达降低,而SM22α,α-SMA,Bax,Cleaved Caspase-3的表达升高(P<0.05)。与正常对照组相比,模型组SOD细胞活性显著降低,MDA活性升高(P<0.05)。与模型组相比,模型+MK2206组和模型+Scutellarin(100μmol/L)组的SOD细胞活性升高,MDA活性降低(P<0.05)。与模型+Scutellarin(100μmol/L)组比较,模型+MK2206+Scutellarin(100μmol/L)组的SOD细胞活性升高,MDA活性降低(P<0.05)。5.4抑制剂BAY11-7082处理实验结果与正常对照组相比,模型组p-PI3K,p-AKT,IKKα/β,p-NF-κBp65,OPN的表达显著升高,SUbiquitin抑制剂M22α,α-SMA,IKBα的表达显著降低(P<0.05)。与模型组相比,模型+BAY组,模型+Scutellarin(100μmol/L)组的p-PI3K,p-AKT,IKKα/β,p购买Alisertib-NF-κBp65,OPN的蛋白表达显著降低,SM22α,α-SMA,IKBα的表达升高(P<0.05)。与模型+Scutellarin(100μmol/L)组比较,模型+BAY+Scutellarin(100μmol/L)组p-PI3K,p-AKT,IKKα/β,p-NF-κBp65,OPN的表达降低,SM22α,α-SMA,IKBα的表达升高(P<0.05)。与正常对照组相比,模型组SOD细胞活性显著降低,MDA活性升高(P<0.05)。与模型组相比,模型+BAY组,模型组+Scutellarin(100μmol/L)组的SOD细胞活性显著升高,MDA活性降低(P<0.05)。与模型+Scutellarin(100μmol/L)组比较,模型+BAY+Scutellarin(100μmol/L)组的SOD细胞活性显著升高,MDA活性降低(P<0.05)。【结论】1灯盏乙素对实验性AS有明显的治疗作用。2灯盏乙素涂层支架通过抑制冠状动脉新生内膜增生和炎症反应,从而抑制PCI术后ISR。3灯盏乙素通过调控平滑肌细胞的表型转换,抑制VSMCs的增殖、迁移,并促进其凋亡;灯盏乙素还明显抑制VSMCs的氧化应激反应。4灯盏乙素分别通过靶向AKT1和NF-κBp65位点,交互调控PI3Κ/AΚT/m TOR及IΚΚs/NF-κB信号通路。