纤维素是木质纤维素生物质的主要成分,是地球上分布最广、含量最丰富的多糖。纤维素酶能将丰富的纤维素资源转化为可利用的糖类物质,在能源、食品、造纸、洗涤等领域中广泛应用。利用微生物产酶分解纤维素,是纤维素开发利用的一种高效、绿色途径。然而,大多数陆源产酶微生物,其纤维素酶酶活性较差,各种环境条件下的耐受性也较弱,这些缺陷严重制约了纤维素资源的开发利用。海洋具有低温、黑暗、高盐和高压等独特的环境,生活其中的海洋微生物具有一些特殊的生理机制和功能来适应极端生态环境,其中包括可产生具有多种特性的海洋纤维素酶。论文以开发可应用于多种场景的高效海洋纤维素酶资源为目的,从筛选产纤维素酶的海洋菌株出发,研究其产纤维素酶的酶学特性,优化菌株的发酵条件,在此基础上,通过对目标菌株全基因组测序,分析挖掘新型的纤维素酶基因,并对其进行异源表达。研究结果如下:本文从西印度洋海底沉积物中筛选获得两株产纤维素酶的海洋细菌,分别为XN149和XE48,通过形态学观察、生理生化实验、分子生物学鉴定及菌种进化分析将菌株XN149鉴定为Bacillus sp.XN149,是芽孢杆菌属(Bacillus sp.)的一个新种;将菌株XE48鉴定为Bacillus halotolerans XE48(耐盐芽孢杆菌)。酶学性质研究发现,菌株XN149和XE48所产纤维素酶的最适反应温度分别是65°C和60°C,具有良好的嗜热性,二者所产纤维素酶分别在p H 5.0～8.0及p H 4.0～8.0条件下处理1 h,相对酶活性可分别保持在90%及85%以上,显示良好的酸碱耐受性,这些温度和酸碱耐受特性,表明二者的纤维素酶具备应用于中高温生产条件及p H值复杂多变体系中的潜力。金属离子对酶的影响方面,Fe~(3+)、Mn~(2+)对菌株XN149所产纤维素酶有一定的促进作用,Ba~(2+)对该菌株酶活性具有抑制作用,Ca~(2+)、Mg~(2+)和EDTA则对酶活性无太大影响。Mn~(2+)、Infectious riskBa~(2+)和EDTA对菌株XE48所产纤维素酶活性具有抑制作用,但未发现其他金属离子对该菌株酶活性有显著促进作用。产酶发酵条件研究发现,菌株XN149的优化培养条件为:海水盐度为30‰,碳源为麸皮,氮源为鱼粉,发酵温度为26°C、接种量为7%,发酵p H为6.0,转速为150 r/min。菌株XE48的优化培养条件为:海水盐度为30‰,碳源为麸皮,氮源为蛋白胨,发酵温度为26°C、接种量为1%,发酵p H为6.0,转速为150 r/min。全基因组测序分析显示,菌株XN149全基因组仅由一个环状染色体组成,大小为3 284 405 bp,预测到3 197个编码基因,KEGG注释中参与碳水化合物代谢的有194个基因,并有452个编码CAZy家族基因,包括126个糖苷水解酶(GHs),其中含有2个内切葡聚糖酶基因;菌株XE48仅由一个环状染色体组成基因组,大小为4 152 610 bp,预测有3 91Puromycin化学结构6个编码基因,KEGG注释到参与碳水化合物代谢的有272个基因,并鉴定出592个CAZy家族基因,包括174个糖苷水解酶,具有1个内切葡聚糖酶基因。本研究利用PCR技术从菌株Bacillus sp.XN14www.selleck.cn/products/ly21572999和B.halotolerans XE48的基因组DNA中成功扩增得到内切葡聚糖酶基因Cel149与Cel48,并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中得到了表达。其中菌株XE48在大肠杆菌中实现了胞外分泌表达,重组内切葡聚糖酶的产量与野生菌株相比,提高了44.5%。