金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)简称“金葡菌”,是自然界常见的革兰氏阳性菌,同时食品中的金黄色葡萄球菌污染也是常见的公共卫生问题。在我国每年因金黄色葡萄球菌及其毒素引发的食物中毒GW4869采购事件位列所有细菌性食物中毒的第三位,仅次于沙门菌和副溶血弧菌。消费者食用被金葡菌或其肠毒素污染的食品,可导致恶心、呕吐、腹泻等胃肠道症状,严重者可发生虚脱甚至休克。鸡肉作为我国居民膳食中常见的的动物性食品之一,其食品安全与消费者息息相关,必须重点关注。近年来我国市售食品中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Meticillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的检出愈发常见,并且随着食品贸易和人员流动,呈现出污染食品种类多、污染地区范围广的特点。目前已发现MRSA导致食物中毒的事件,甚至存在食品来源MRSA致人严重感染的医疗事件报道,因此食品中MRSA污染可对消费者造成较大的安全风险。本研究通过对济南市售生鸡肉中金黄色葡萄球菌污染情况进行调查,评估其造成食源性疾病暴发的风险,并通过药敏试验和全基因组序列分析对菌株的型别、耐药性、耐药基因毒力基因流行特征进行阐述,了解济南市售生鸡肉中金葡菌的基因组流行病学特征;同时筛选MRSA菌株,并对其主要型别、致病性和生物膜形成能力进行检测。本研究结果阐述了济南市售生鸡肉中金黄色葡萄球菌污染特征和致病风险,为食品中食源性致病菌污染防控和降低食源性疾病暴发风险提供基础数据支持。目的1.对济南市售生鸡肉中金黄色葡萄球菌污染情况进行调查分析,并对其导致食源性疾病暴发的风险进行评估。检测菌株的耐药特征,并通过全基因组序列分析了解菌株主要流行型别、各型别菌株耐药基因毒力基因流行特征以及遗传进化关系。2.筛选MRSA菌株,探讨污染来源,分析MRSA菌株致病特征,评估食品中MRSA污染对人潜在危害。方法1.样品采集和检测:本研究自2021年3月～2021年11月对济南市各区各大超市、农贸市场等地点市售生鸡肉进行采集,每月20份。参考GB 4789.10—2016《食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》对样品中金葡菌污染率污染水平进行检测,并对可疑菌株进行分离纯化冻存。2.菌株复核及肠毒素基因鉴定:使用PCR扩增技术对菌株中5种经典肠毒素基因携带情况进行检测;同时使用PCR和飞行时间质谱仪对菌株种属进行复核鉴定。3.数据整理和风险评估:根据样品类型和采样地点将样品分组,计算各组样品中金葡菌污染率和污染水平。使用SPSS 25.0对各组检测结果进行统计分析,使用Risk Ranger半定量风险评估软件对各组样品中金葡菌导致食源性疾病暴发风险进行评估。4.抗菌药embryo culture medium物敏感性检测:选取13类19种抗菌药物,使用微量肉汤法和琼脂稀释法对菌株各抗菌药物的最低抑菌浓度进行检测,参照CLSI抗微生物药物敏感性实验执行标准对菌株耐药性进行判定。5.菌株序列分析:提取菌株遗传序列进行二代测序,拼接获得菌株全基因组序列,上传在线比对平台Center for Genomic Epidemiology(CGE)比对得到菌株型别、耐药基因毒力基因携带情况及遗传进化关系。6.MRSA筛选及致病特征分析:根据菌株耐药表型和基因型筛选MRSA菌株,通过大蜡螟毒力实验验证菌株致病性,使用刚果红琼脂法确定菌株生物膜形成能力,结合耐药表型分析MRSA菌株致病特征。结果1.180份市售生鸡肉样品中共检出金黄色葡萄球菌阳性样品55份,总体检出率为30.56%,其中超市来源冷冻鸡制品中检出率为26.23%,农贸市场、肉制品零售店来源冷冻鸡制品检出率为50.00%,鲜整鸡检出率为15.25%。55份定性结果为阳性的样品中,污染水平总体几何均数为21.9 MPN/g。55株菌株经多种方法鉴定均为金黄色葡萄球菌。2.风险评估结果提示济南市售生鸡肉中金黄色葡萄球菌导致消费者患食物中毒的总体风险等级为高风险,风险值最高的是农贸市场、肉制品零售店来源的冷冻鸡制品,风险值为53;其次是鲜整鸡,风险值为52;大型超市、电商平台来源的冷冻鸡制品风险值最低,风险值为49。3.本研究的55株金黄色葡萄球菌中,共检测出14种ST型,20种spa型,其中检出最多的是ST7型,共26株,为本地区优势型别。其中22株为ST7-t91型金黄色葡萄球菌,3株为ST7-t976型金黄色葡萄球菌,1株为ST7-t605型金黄色葡萄球菌。不同型别菌株表现出不同耐药基因和毒力基因流行特征。4.菌株整体耐药率为98.18%;其中多重耐药率为54.55%。本研究选取的13类19种抗菌药物中,菌株对青霉素耐药率最高,达到了 92.73%(51/55),对红霉素、四环素耐药率为56.36%(31/55),克林霉素耐药率为54.55%(30/55)。所有菌株均对头孢洛林、万古霉素、替考拉宁、达托霉素、利奈唑胺、替加环素、呋喃妥因敏感,有5株菌株表现出利福平中介。5.55株菌株中共有8株为MRSA,有7株为多重耐药菌株,所有菌株均表现出对苯唑西林、头孢西丁、青霉素耐药;同时部分菌株对红霉素、克林霉素、四环素、氯霉素、庆大霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星等抗菌药物耐药。所有MRSA均具有生物膜形成能力。6.8株MRSA共有4种ST型,除了本地LA-MRSA常见型别,还有国外流行LA-MRSA,CA-MRSA常见型www.selleck.cn/products/gsk1120212-jtp-74057别。大蜡螟毒力实验结果显示实验幼虫死亡数量与菌株毒力基因携带数量正相关,携带杀白细胞素基因的菌株可能具有更高致病性。结论:1.济南市售生鸡肉中存在一定程度的金黄色葡萄球菌污染,尤其在冷冻鸡制品中具有较高污染率,污染导致食源性疾病暴发的风险较高,相关部门应加强监管,采取针对性措施控制食品中致病微生物污染,降低食源性疾病暴发风险。2.污染菌株型别多样,ST7型为本地优势污染型别。菌株对畜牧业常用抗菌药物具有较高耐药率,对临床常用细菌感染治疗药物敏感,但是发现部分菌株携带利福霉素类耐药基因突变,表现为利福平中介,应持续关注。菌株毒力基因携带率高且种类广泛,除肠毒素基因外,部分菌株还携带杀白细胞素基因和中毒休克综合征基因,存在致人罹患严重细菌感染风险。3.污染菌株中MRSA占比逐渐上升,污染型别复杂,来源多样。菌株具有较强的耐药性和致病能力,同时生物膜形成能力较强,具有较大的健康隐患,应针对食品中MRSA污染问题,加大监测和溯源力度,控制食品中MRSA的污染和传播。