JIP(JNK-interacting protein)蛋白作为JNK MAPK(应激活化蛋白激酶-丝裂原活化蛋白激酶)信号通路中的支架蛋白,可以通过与JNK MAPK信号通路中的其他成员相互作用,从而激活JNK等下游因子,继而参与生物体细胞分裂、凋亡等生理过程。在哺乳动物中,JIP4可在睾丸中高表达并定位在生殖细胞中,可参与雄性动物的生殖过程。镉(Cadmium,Cd)作为一种有毒重金属,可以通过多种途径进入水体中,造成水体污染。镉进入水生动物体内在器官中积累引起功能紊乱。研究表明,镉暴露会使睾丸萎缩,形态结构发生改变,引起生精细胞凋亡、精子发生障碍,精子数量减少,活力下降,影响生殖能力,甚至引起不育。本课题对河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)中JIP4蛋白的表达特性以及镉胁迫效应进行了研究。内容包括三个方面:(1)河南华溪蟹Shjip4基因全长获selleck PD-0332991得、生物信息学分析和组织表达模式分析采用RACE-PCR技术,克隆获得Shjip4基因c DNA全长,分析核酸和氨基酸序列,通过对河南华溪蟹Shjip4基因蛋白结构域序列进行预测并推测其功能。同时,构建河南华溪蟹与其他物种JIP4蛋白系统发育进化树,分析其进化地位。此外,取副性腺、血淋巴、肝胰腺、心肌、精巢、鳃、卵巢、中肠8种器官组织,提取各组织总RNA并将其反转录成为c DNA,利用q PCR定量检测Shjip4在各组织中的分布情况。(2)ShJIP4蛋白在河南华溪蟹精巢及精子顶体反应中定位研究取河南华溪蟹精巢,经固定、脱水、透明、浸蜡包埋,并利用A23187诱导精子的顶体反应,采用免疫荧光技术,观察ShJIP4蛋白在精子发生和顶体反应过程中的定位情况。(3)镉暴露对河南华溪蟹精巢中ShJIP4的影响实验设置了14.5 mg/L(1/16 LC_(50))、29 mg/L(1/8 LC_(50))、58 mg/L(1/4 LC_(50))Cd Cl_2三个实验组和一个空白对照组(control),在镉暴露1 d、3 d、5 d取精巢提取总RNA,并反转录成c DNA,检测Shjip4、cdc42、mkk、jnk基因m RNA的表达量。同时,用免疫荧光probiotic persistence法分析镉暴露后ShJIP4在精巢中的分布情况。利用Western blot技术,检测镉暴露后精巢中ShJIP4蛋白的表达。研究结果如下:(1)河南华溪蟹Shjip4基因克隆与生物信息学分析及组织表达。河南华溪蟹Shjip4基因全长共3355 bp,包含62 bp的5’非编码区(5’UTR),2628 bp的开放阅读框(ORF)和665 bp的3’非编码区(3’UTR)。其中,开放阅读框编码875个氨基酸。ShJIP4氨基端有一个保守的JNK-Sap K＿ap＿N结构域。氨基酸全长序列同一性结果显示,河南华溪蟹ShJIP4与甲壳纲三疣梭子蟹(Portunus trituberKPT-330culatus)Pt JIP4相似度最高。河南华溪蟹ShJIP4先与甲壳纲JIP4聚为一支,再与脊椎动物鱼纲、鸟纲、哺乳纲聚为一支,与传统分类学一致。河南华溪蟹Shjip4在各个组织中均有不同程度的表达,且在精巢中表达最高。(2)ShJIP4蛋白参与河南华溪蟹精子发生和顶体反应过程。ShJIP4蛋白在精子发生过程中的定位分布:精原细胞期,主要定位在细胞质中;初级精母细胞期,主要定位在细胞质,在细胞核中略有分布;次级精母细胞期,主要在细胞核中分布;精细胞期,主要分布在细胞核以及顶体结构中。ShJIP4蛋白在精子未发生顶体反应阶段主要定位于细胞核和顶体帽中;在头帽凸起阶段,主要定位于顶体帽和顶体囊中;顶体囊外翻阶段,主要定位于顶体帽和顶体管中;在顶体管延伸阶段,主要定位顶体帽中;在顶体反应完成阶段,定位于顶体帽中。(3)镉暴露对河南华溪蟹精巢ShJIP4的影响。镉暴露后,精巢中Shjip4、cdc42、mkk和jnk基因m RNA表达量较对照组相比均有显著升高(P<0.05),在同一时间不同镉浓度,Shjip4、cdc42、mkk和jnk基因m RNA表达量呈现先升高后降低的趋势。镉暴露后精巢中ShJIP4蛋白表达量的变化升高,并随着镉处理浓度的升高呈现先升高后降低的趋势,这与Shjip4 m RNA的表达的变化趋势基本一致。结果表明,河南华溪蟹ShJIP4参与了精子发生和顶体反应过程,镉暴露激活了JNK MAPK信号转导通路,上调了ShJIP4的表达。研究结果为十足目甲壳动物JIP4蛋白的功能、生殖调控机制提供了理论基础,为镉对甲壳类动物生殖毒性的毒性效应及作用机制,提供了数据支撑。