氯吡脲是一种人工合成的苯脲衍生细胞分裂素,广泛用作植物生长调节剂,主要用于增加猕猴桃和葡萄等水果的大小。农用化学品的频繁使用可能导致食品中存在残留物,我国政府部门明确规定了氯吡脲在不同果蔬中的残留量。为了确保监测系统在食品风险管理方面的有效性,目前针对氯吡脲残留检测以色谱为主的仪器分析方法。仪器检测结果比较可靠,但仪器昂贵、耗时,需要训练有素的专业人员实现检测。基于抗体和抗原特异性结合的免疫分析已成为用于测定痕量分析物的成熟技术,相比色谱分析具有操作简便、高通量、结果快的优点。免疫测定通常使用单克隆抗体,为了实现这一目标,生产具有灵敏度高、特异性好、稳定性强的抗体至关重要。因此,本课题旨在筛选可识别氯吡脲的单克隆抗体,同时基于单克隆抗体建立了对氯吡脲残留可追溯性的磁珠酶联免疫吸附分析(ELISA)量化方法。为了避免杂交瘤细胞的突变,研制了制备成本低、易获得的单链抗体。本论文所做的工作为氯吡脲残留的快速检测提供了新思路,具体研究内容如下:1.氯吡脲的单克隆抗体制备为了制备高灵敏度的抗氯吡脲单克隆抗体,利用异源包被筛选,选取氯吡脲偶联卵清蛋白的完全抗原(CPPU-OVA)作为免疫原,在杂交瘤细胞筛选以及ELISA实验分析均使用氯吡脲偶联牛血清蛋白的完全抗原(CPPU-BSA)作为包被原,进行了三轮亚克隆筛选得到两株稳定分泌抗体的细胞株(14G1、16B1)。通过间接竞争ELISA比较两株杂交瘤细胞产生在腹水的抗体灵敏度,最终选择14G1杂交瘤细胞株用于生产单克隆抗体。14G1杂交瘤细胞分泌的抗体亚型为Ig G1型,经辛酸-硫酸铵法纯化后的亲和常数(Ka)为4.74×10~(10)L/mol,为高亲和力抗体。经抗原包被浓度、工作缓冲液相关参数条件优化,最终优化的抗体的IC_(50)为0.0253 ng/m L,特异性好,线性范围(IC_(20)～IC_(80))为0.005～0.231 ng/m L,所制备的单克隆抗体为氯吡脲免疫分析方法的构建提供重要的生物材料。2.磁珠ELISA方法的建立及在猕猴桃和葡萄样品氯吡脲的检测应用研究使用磁珠纳米材料构建的免疫分析方法能够提高检测的灵敏度并且可以实现对实际样品残留的快速检Gene biomarker测。Berzosertib抑制剂以链霉亲和素磁珠偶联生物素化氯吡脲抗原的复合物作为包被抗原,HRP偶联的抗氯吡脲单克隆抗体作为一抗来构建直接竞争磁珠ELISA(MB-ELISA)反应体系。经过相关参数条件优化后的MB-ELISA的IC_(50)为0.0061 ng/m L,在35 min内完成检测,大大缩短分析时间,并且与其他类似物没有交叉反应。将常规ELISA、MB-ELISA和HPLC用于猕猴桃和葡萄样品中氯吡脲的添加回收实验。结果表明,常规ELISA和MB-ELISA的基质分别稀释200倍、100倍。三种分析方法的加标回收率分别为99.0%～117.4%、86.0%～120.0%和82.0%～116.5%,变异系数都小于14.3%。验证了免疫分析方法在猕猴桃和葡萄样品检测的实用性和准确性,可用于水果中氯吡脲残留的高通量筛选检测。3.氯吡脲单链抗体的制备及分子识别机理的初步研究基因工程抗体(单链抗体)可替代传统抗体的制备途径。从14G1杂交瘤细胞株提取m RNA并反转录成c DNA,以此为模板扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),其两个基因片段通过连接肽组装成单链抗体(sc Fv)基因,将sc Fv插入p ET32m和p ET32m-MBP载体上并在大肠杆菌里实现体外的重组蛋白表达。经过Ni柱纯化并建立了sc Fv-ELISA曲线,其对氯吡脲的IC_(50)为0.13ng/m L,仍然保留了原单克隆抗体的结合能力,可以作为氯吡脲单克隆抗体制备的替代方法,但是发现融合蛋白(MBP-sc Fv)失去了对氯吡脲小分子的结合能力。最后使用同源建模、分子对接等计算模拟,显示了sc Fv中的Asn30(CDR1)、Trp32(CDR1)、Ser99(CDR3)参与氢键相互作用,这为抗体进化、免疫结合机制提供了信息和理论基础。综上所述,本论文制备了高灵敏度、高特异性的抗氯吡脲单克隆抗体和单链抗体;基于单克隆抗体构建了磁珠ELISA实现了快速、高灵敏度的分析检测;ELISA、MB-ELISA分析方法均可满NSC 125973足在实际样品的检测需求。