高质量的猪精液是现代养猪业降本增效的重要因素,而精液保存技术是实现高质量猪精液高效利用的关键。目前,常温保存是生产中猪精液保存的主要方式,但随着保存时间的延长,猪精子质量会持续下降。主要原因是精液保存中过量的活性氧(ROS)造成了精子的氧化应激。此外,细菌污染也会对精子质量产生不利影响。氧化石墨烯-银纳米复合物(GO-Ag NPs)有广泛的抗菌特性,且不易产生耐药性。在此背景下,本研究通过分析GO-Ag NPs在猪精液17℃保存中的应用效果以及对猪精子细胞的作用机制,为高质量猪精液长时间保存提供技术支持。通过研究GO-Ag NPs的抑菌效果和机制,寻找猪精液稀释液中抗生素的替代产品,从而解决抗生素耐药引起精液污染的问题,为纳米颗粒在猪精液保存中的应用提供理论依据。一、GO-Ag NPs对猪精子质量和功能的影响将猪精液样品用含有不同浓度GO-Ag NPs(0、0.5、1、2、4、8和16μg/mL)的BTS稀释至25 × 106/mL,17℃下液态保存5d。结果表明,与对照组相比,在稀释液中添加0.5～8 μg/mL的GO-Ag NPs没有显著影响猪精子的质量和功能(P>0.MC3纯度05),而添加16 μg/mL的GO-Ag NPs显著降低了猪精子的运动能力和质膜完整性(P<0.05)。在保存24 h后取样使用透射电镜观察精子超微形态,相比8 μg/mL GO-Ag NPs,添加16 μg/mL GO-Ag NPs导致精子质膜破损、轴丝结构异常、线粒体和微管缺失。与对照组相比,16 μg/mL的GO-Ag NPs显著升高了精子细胞内RHepatic cystOS水平和MDA含量(P<0.05),显著升高了精浆和精子细胞内SOD活力(P<0.05)。与第0 d和3 d对照组相比,GO-Ag NPs组显著降低AMP/ATP比值(P<0.05),显著升高了 p-AMPKα、LKB-1和PGC-1α的表达量(P<0.05)。综上,添加0.5～8 μg/mL的GO-Ag NPs没有显著影响精子质量和功能,而16μg/mL的GO-Ag NPs通过引起活精子氧化应激造成猪精子质量和功能下降。精子遭受氧化应激时,AMPK通过LKB-1的上调被激活并触发PGC-1α依赖性抗氧化反应,调控精子或selleck CX-5461精浆中的抗氧化物来对抗氧化应激,从而有利于精子质量和功能的维持。二、GO-Ag NPs在猪精液保存中的抑菌作用选择商品化公猪站的新鲜精液,研究GO-Ag NPs在猪精液保存中抑菌作用。①对两个商业化公猪站的72份精液(来自36头公猪)进行细菌培养,对形态有差异的菌落进行质谱鉴定。发现,精液保存的前5 d没有细菌生长,到第5 d,菌落数达到103～105 CFU/mL,常见菌株为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、产酸克雷伯菌和变形杆菌。②向猪精液(25 × 106/mL)中添加不同浓度(0、0.5、1、2、4、8和16 μg/mL)的GO-Ag NPs,研究其在精液保存中的抑菌作用。结果发现,0.5～4 μg/mL的GO-Ag NPs对菌落生长没有明显作用(P>0.05),而8μg/mL 和 16 μg/mL 的 GO-Ag NPs 显著抑制了菌落的生长(P<0.01)。GO-Ag NPs对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、产酸克雷伯菌和奇异变形杆菌的MIC分别是8、8、16和16 μg/mL,MBC分别是16、16、32和32 μg/mL,抗菌效果优于抗菌肽,与广谱抗生素相当。比较GO-Ag NPs与不同稀释液的配伍效果,发现其与A稀释液配伍对精子活率、活力和质膜完整性的维持效果显著优于其他稀释液组(P<0.01)。③为探讨大肠杆菌污染对精子的影响,用含不同浓度(0、103和105 CFU/mL)大肠杆菌的A稀释液重悬精子至25 × 106/mL,并于17℃下保存120 h。结果表明,保存72 h后,大肠杆菌组均显著降低了精子质量和功能(P<0.01),显著升高了精液中内毒素水平(P<0.01)。④为探究GO-Ag NPs对大肠杆菌的抑菌作用,将猪精液样品进行不同处理,设置为对照组、大肠杆菌组(1×105 CFU/mL)和大肠杆菌(1×105 CFU/mL)+GO-Ag NPs(8μg/mL)组。结果表明,GO-Ag NPs显著缓解大肠杆菌对精子造成的质量损伤(P<0.05),显著降低精液中内毒素水平(P<0.01),血平板培养未见有大肠杆菌生长,电镜结果发现细菌与精子的黏附现象减少。免疫荧光结果表明,LPS能够结合到精子头部和尾部,而GO-Ag NPs对LPS与精子的结合没有显著影响。⑤为探究GO-Ag NPs在精液保存中的抑菌机制,将猪精液样品进行不同处理,设置为对照组、LPS组(3.3 μg/ml)、大肠杆菌组和LPS+GO-Ag NPs(8 μg/ml)组。结果发现,大肠杆菌组显著升高了细胞内ROS水平和MDA含量(P<0.01),显著降低了精子活率和活力(P<0.01);LPS组没有显著影响精子质量和功能(P>0.05);LPS+GO-Ag NPs组显著升高了精浆和精子细胞内抗氧化物酶(SOD和CAT)活性,显著升高了 p-AMPK、LKB-1和CaMKKβ蛋白表达量和AMP/ATP比值(P<0.05)。综上,8 μg/mL的GO-Ag NPs能够显著抑制细菌的生长且与A稀释液配伍效果最好,能够缓解大肠杆菌污染对精子质量的损伤。GO-Ag NPs是通过直接抑制大肠杆菌的生长来发挥抑菌作用,而不是通过影响LPS与精子的结合。GO-Ag NPs通过促进精子AMPK的激活,提高胞内抗氧化物酶的活性来应答大肠杆菌造成的氧化应激。