目的:探讨铁死亡(Ferroptosis)在铝致原代神经元死亡中的作用,研究氧化损伤和铁代谢异常在铝致原代神经元Ferroptosis中的可能作用机制,为进一步研究铝的神经毒性及其机制提供理论依据。方法:分离出生24 h SD大鼠新生鼠大脑皮层,提取原代神经元并进行培养。用含终浓度分别为0、25、50、75、100、200和400μmol/L麦芽酚铝(Aluminum maholate,Al(mal)_3)的原代神经元特异性Neurobasal?-A培养基分别培养原代神经元12 h、24 h和48 h,采用CCK-8法测定上述不同染毒时间和染毒剂量下原代神经元的存活率,取存活率为65%-75%所对应的染毒剂量和染毒时间进行后续实验。将原代神经元分为13组,终浓度分别为:0μmol/LAl(mal)_3组、0.5%二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)组、100μmol/L Al(mal)_3组、50μmol/L坏死性凋亡抑制剂(Necrostatin-1,Nec-1)组、20μmol/L凋亡抑制剂(Z-VAD(OH)-FMK,Z-VAD-FMK)组、50μmol/L自噬抑制剂(3-Methyladenine,3-MA)组、50μmol/L去铁胺(Deferoxamine,DFO)组和20μmol/L铁死亡诱导剂(Ferroptosis inducer,FINO_2)组以及100μmol/L Al(mal)_3+Nec-1组、100μmol/L Al(mal)_3+Z-VAD-FMK组、100μmol/L Al(mal)_3+3-MA组、100μmol/L Al(mal)_3+DFO组和100μmol/L Al(mal)_3+FINO_2组。联合染毒时0.5%DMSO、50μmol/L Nec-1、20μmol/L Z-VAD-FMK、50μmol/L 3-MA、50μmol/L DFO和20μmol/L FINO_2均在添加终浓度为100μmol/L Al(mal)_3前2 h加入进行预处理,培养箱中培养24 h后进行后续实验。采用CCK-8法测定原代神经确认细节元存活率,采用倒置显微镜观察微管关联蛋白2(Microtubule-associated protein 2,MAP2)和DAPI荧光染色后的细胞形态改变。采用Western-blot法检测原代神经元氧化还原相关蛋白——溶质载体家族7成员11(Solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化酶4(Monoclonal antibody to glutathione peroxidase 4,GPX4)表达水平。分别使用谷胱甘肽过氧化物酶测试盒和还原型谷胱甘肽测试盒测定谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)活力和谷胱甘肽(Glutathione,GSH)含量。采用Western-blot法检测原代神经元铁代谢相关蛋白——转铁蛋白受体1(Transferrin receptor 1,TFR1)、二价金属离子转运体(Divalent metal transporter 1,DMT1)和铁蛋白重链(Ferritin heavy chain,FTH1)蛋白表达水平。原代神经元TFR1、DMT1、FPN1和FTH1m RNA表达水平则采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR)检测。通过比较Al(mal)_3单独染毒及其与DFO和FINO_2联合染毒对SD大鼠新生鼠皮质原代神经元存活率、细胞形态、氧化损伤相关指标以及铁代谢相关指标的影响,探索铝致原代神经元铁死亡的可能机制。结果:1.确定Al(mal)_3染毒剂量和染毒时间使用终浓度为0、25、50、75、100、200和400μmol/L Al(mal)_3染毒原代神经元12 h时,原代神经元存活率没有明显变化(P>0.05);使用终浓度为100、200和400μmol/L Al(mal)_3染毒原代神经元24 h、48 h后,原代神经元存活率明显降低(P<0.05)。取原代神经元存活率为65%-75%的染毒剂量(100μmol/L Al(mal)_3)和染毒时间(24h)进行后续实验。2.Ferroptosis在铝致原代神经元死亡中的作用对Al(mal)_3单独或与DFO、FINO_2联合染毒24 h的原代神经元存活率进行测定发现,20μmol/L FINO_2组、100μmol/L Al(mal)_3+DMSO组和100μmol/L Al(mal)_3+FINO_2组原代神经元存活率分别为(18.76±0.002)%、(71.92±0.04)%和(15.42±0.002)%,较0μmol/L Al(mal)_3组原代神经元存活率(100.00±0.00)%显著下降,差异具有统计学意义(P<0.05);100μmol/L Al(mal)_3组、20μmol/L FINO_2组、100μmol/L Al(mal)_3+DMSO组和100μmol/L Al(mal)_3+FINO_2组原代神经元存活率分别为(72.81±0.04)%、(18.76±0.002)%、(71.92±0.04)%和(15.42±0.002)%,与0.5%DMSO组原代神经元存活率(102.59±0.05)%相比均降低(P<0.05);与100μmol/L Al(mal)_3+DMSO组原代神经元存活率(71.92±0.04)%相比,50μmol/L DFO组(113.59±0.05)%和100μmol/L Al(mal)_3+DFO组(95.42±0.06)%均升高(P<0.05),20μmol/L FINO_2组(18.76±0.002)%和100μmol/L Al(mal)_3+FINO_2组(15.42±0.002)%均降低(P<0.05)。采用荧光染色法对Al(mal)_3单独或与DFO和FINO_2联合染毒24 h的原代神经元形态进行观察发现,0μmol/L Al(mal)_3组、0.5%DMSO组和50μmol/L DFO组神经元胞体饱满圆润,轴突清晰且互相交织成网,100μmol/L Al(mal)_3组、100μmol/L Al(mal)_3+DMSO组、20μmol/L FINO_2组以及100μmol/L Al(mal)_3+FINO_2组神经元胞体变小,边缘模糊不清,树突形态表现为断裂、变形,且相互连接变少。100μmol/L Al(mal)_3+DFO组神经元状态恢复较好,有部分轴突变短且与周围神经元连接不明显,但大部分神经元胞体形态圆滑且轴突细长粗壮,交织成肉眼可见的浓密网状。对Al(mal)_3单独或与DFO和FINO_2联合染毒24 h的原代神经元总荧光强度进行比较发现,100μmol/L Al(mal)_3组、20μmol/L FINO_2组、100μmol/L Al(mal)_3+DMSO组和100μmol/L Al(mal)_3+FINO_2组的总荧光强度分别为(339.16±7.97)、(296.06±9.95)、(297.05±7.68)和(284.70±6.26)与0μmol/L Al(mal)_3组原代神经元总荧光强度(372.89±3.61)相比明显降低(P<0.05);与0.5%DMSO组总荧光强度(320.08±15.46)相比,100μmol/L Al(mal)_3组总荧光强度(339.16±7.97)和100μmol/L Al(mal)_3+FINO_2组总荧光强度(284.70±6.26)均降低,且差异具有统计学意义(P<0.05);100μmol/L Al(mal)_3+FINO_2组总荧光强度(284.70±6.26)相比于100μmol/L Al(mal)_3+DMSO组总荧光强度(297.05±7.68)进一步降低(P<0.05)。3.坏死、凋亡、自噬在铝致原代神经元死亡中的作用Al(mal)_3单独或与Z-VAD-FMK、Nec-1和3-MA联合24 h后,原代神经元存活率检测结果显示:与0μmol/L Al(mal)_3组原代神经元存活率(100±0.00)%相比,100μmol/L Al(mal)_3组、100μmol/L Al(mal)_3+DMSO组、100μmol/L Al(mal)_3+Nec-1组、100μmol/L Al(mal)_3+Z-VAD-FMK组和100μmol/L Al(mal)_3+3-MA组原代神经元存活率明显下降,分别为(72.81±0.04)%、(71.94±0.03)%、(59.26±0.04)%、(61.50±0.03)%和(56.73±0.03)%,差异具有统计学意义(P<0.05);100μmol/L Al(mal)_3组、100μmol/L Al(mal)_3+DMSO组、100μmol/L selleck合成Al(mal)_3+Nec-1组、100μmol/L Al(mal)_3+Z-VAD-FMK组和100μmol/L Al(mal)_3+3-MA组的原代神经元存活率分别为(72.81±0.04)%、(71.94±0.03)%、(59.26±0.04)%、(61.50±0.03)%和(56.73±0.03)%,与0.5%DMSO组原代神经元存活率(102.59±0.05)%相比明显降低(P<0.05);不同死亡方式抑制剂单独作用组即50μmol/L Nec-1组、20μmol/L Z-VAD-FMK组和50μmol/L 3-MA组的原代神经元存活率分别为(110.87±0.03)%、(98.47±0.04)%、(106.07±0.04)%,均高于100μmol/L Al(mal)_3+DMSO组原代神经元存活率(71.94±0.03)%,且差异具有统计学意义(P<0.05);而联合染毒组即100μmol/L Al(mal)_3+Nec-1组、100μmol/L Al(mal)_3+Z-VAD-FMK组和100μmol/L Al(mal)_3+3-MA组原代神经元存活率分别为(59.26±0.04)%、(61.50±0.03)%和(56.73±0.03)%,均低于100μmol/L Al(mal)_3+DMSO组原代神经元存活率(71.94±0.03)%,差异具有统计学意义(P<0.05)。综上,不同死亡方式抑制剂组并未使得由Al(mal)_3染毒所导致的原代神经元存活率有明显升高。采用荧光染色法对Al(mal)_3单独或与Nec-1、Z-VAD-FMK和3-MA联合染毒原代神经元24 h的原代神经元形态进行观察发现,50μmol/L Nec-1组、20μmol/L Z-VAD-FMK组和50μmol/L 3-MA组单独处理原代神经元时,其形态无明显改变,胞体大而饱满,轴突相互连接,均匀交织成网;而当Al(mal)_3与其联合染毒时,即100μmol/L Al(mal)_3+Nec-1组、100μmol/L Al(mal)_3+Z-VAD-FMK组和100μmol/L Al(mal)_3+3-MA组中网状细胞结构明显减少,轴突断裂、胞体皱缩,神经元网络疏松。对Al(mal)_3单独或与Nec-1、Z-VAD-FMK和3-MA联合染毒24 h的原代神经元总荧光强度进行比较发现,100μmol/L Al(mal)_3组、100μmol/L Al(mal)_3+DMSO组和100μmol/L Al(mal)_3+3-MA组总荧光强度分别为(372.89±3.61)、(297.05±7.68)和(292.90±8.09),与0μmol/L Al(mal)_3组相比明显降低(P<0.05);联合染毒组100μmol/L Al(mal)_3+Nec-1组、100μmol/L Al(mal)_3+Z-VAD-FMK组和100μmol/L Al(mal)_3+3-MA组的总荧光强度分别为(312.09±3.83)、(314.52±3.80)和(292.90±8.09),仍未恢复至单独染毒的50μmol/L Nec-1组、20μmol/L Z-VAD-FMK组和50μmol/L 3-MA组的总荧光强度水平,分别为(329.04±9.95)、(323.33±6.07)和(340.36±8.59),差异无统计学意义(P>0.05)。4.铝致原代神经元Ferroptosis的可能机制与0μmol/L Al(mal)_3组SLC7A11蛋白表达(1.18±0.13)相比,100μmol/L Al(mal)_3组、20μmol/L FINO_2组和100μmol/L Al(mal)_3+FINO_2组的SLC7A11蛋白表达分别为(0.97±0.15)、(0.83±0.10)和(0.85±0.06),均降低但差异无统计学意义(P>0.05);与0.5%DMSO组SLC7A11蛋白表达(1.07±0.10)相比,20μmol/L FINO_2组和100μmol/L Al(mal)_3+FINO_2组的SLC7A11蛋白表达分别为(0.83±0.10)和(0.85±0.06),均降低但差异无统计学意义(P>0.05);与100μmol/L Al(mal)_3+DMSO组SLC7A11蛋白表达(1.22±0.06)相比,100μmol/L Al(mal)_3+FINO_2组的SLC7A11蛋白表达(0.85±0.06)降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。对各组原代神经元GPX4蛋白表达水平进行测定发现,与0μmol/L Al(mal)_3组GPX4蛋白表达(1.25±0.78)相比,GPX4蛋白在100μmol/L Al(mal)_3组(0.80±0.04)、20μmol/L FINO_2组(0.84±0.19)和100μmol/L Al(mal)_3+DMSO组(0.89±0.17)表达均降低,差异无统计学意义(P>0.05),100μmol/L Al(mal)_3+FINO_2组GPX4蛋白表达(0.61±0.19)与0μmol/L Al(mal)_3组GPX4蛋白表达(1.25±0.78)相比显著降低(P<0.05);与0.5%DMSO组GPX4蛋白(1.02±0.15)相比,GPX4蛋白在20μmol/L FINO_2组(0.84±0.19)和100μmol/L Al(mal)_3+FINO_2组(0.61±0.19)表达均降低,差异无统计学意义(P>0.05);与100μmol/L Al(mal)_3+DMSO组GPX4蛋白表达(0.89±0.17)相比,100μmol/L Al(mal)_3+DFO组的GPX4蛋白表达(1.37±0.07)升高,而100μmol/L Al(mal)_3+FINO_2组GPX4蛋白表达(0.61±0.19)降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。对原代神经元GSH-PX含量进行测定发现,与0μmol/L Al(mal)_3组原代神经元GSH-PX含量(211.68±3.74)活力单位/mg prot相比,100μmol/L Al(mal)_3组GSH-PX含量(211.68±3.74)、20μmol/L FINO_2组GSH-PX含量(146.91±6.44)和100μmol/L Al(mal)_3+FINO_2组GSH-PX含量(108.22±6.2)均明显降低(P<0.05);20μmol/L FINO_2组和100μmol/L Al(mal)_3+FINO_2组的GSH-PX含量分别为(146.91±6.44)、(108.22±6.2),与0.5%DMSO组(205.37±1.36)相比均明显降低(P<0.05);与100μmol/L Al(mal)_3+DMSO组GSH-PX含量(168.31±4.41)相比,100μmol/L Al(mal)_3+FINO_2组(108.22±6.2)的GSH-PX含量降低(P<0.05);50μmol/L DFO组(205.37±1.36)和100μmol/L Al(mal)_3+DFO组(188.13±5.51)的GSH-PX含量均有所升高回升(P>0.05)。对原代神经元GSH含量(μmol/g prot)的分析结果如下:与0μmol/L Al(mal)_3组(80.40±6.37)μmol/g prot和0.5%DMSO组(85.52±8.66)μmol/g prot相比,20μmol/L FINO_2组的GSH含量(60.60±3.69)μmol/g prot和100μmol/L Al(mal)_3+FINO_2组的GSH含量(51.71±4.71)μmol/g prot均降低(P<0.05);与100μmol/L Al(mal)_3+DMSO组GSH含量(66.55±3.75)μmol/g prot相比,0.5%DMSO组GSH含量(85.52±8.66)μmol/g prot和50μmol/L DFO组GSH含量(85.56±4.59)μmol/g prot明显升高(P<0.05);100μmol/L Al(mal)_3+DFO组的GSH含量(75.32±4.76)μmol/g prot高于100μmol/L Al(mal)_3+DMSO组的GSH含量(66.55±3.75)μmol/g prot,但差异无统计学意义。对原代神经元内总铁含量进行统计分析后结果如下:与0μmol/L Al(mal)_3组总铁含量(9.31±2.54)μmol/g prot和0.5%DMSO组总铁含量(7.08±1.48)μmol/g prot相比,100μmol/L Al(mal)_3组、20μmol/L FINO_2组和100μmol/L Al(mal)_3+FINO_2组总铁含量分别为(16.73±2.09)μmol/g prot、(19.12±2.79)μmol/gprot和(21.97±3.89)μmol/g prot,均明显上升(P<0.05);与100μmol/L Al(mal)_3+DMSO组总铁含量(13.39±1.95)μmol/g prot相比,100μmol/L Al(mal)_3+FINO_2组总铁含量(21.97±3.89)μmol/g prot明显上升(P<0.05)。对原代神经元FTH1表达水平分析结果如下:与0μmol/L Al(mal)_3组(1.37±0.46)和0.5%DMSO组(0.74±0.11)相比,FTH1蛋白表达在100μmol/L Al(mal)_3组(6.96±1.08)、20μmol/L FINO_2组(5.42±1.53)和100μmol/L Al(mal)_3+FINO_2组(9.42±2.89)均明显上升(P<0.05);与100μmol/L Al(mal)_3+DMSO组FTH1蛋白表达(3.07±0.30)相比,100μmol/L Al(mal)_3+FINO_2组表达(9.42±2.89)明显升高(P<0.05),而与100μmol/L Al(mal)_3+DFO组之间的蛋白表达(3.43±0.71)无明显差异(P>0.05)。对原代神经元中铁代谢相关蛋白TFR1表达水平分析结果如下:与0μmol/L Al(mal)_3组(1.35±0.25)以及0.5%DMSO组(1.44±0.12)相比,TFR1蛋白表达在100μmol/L Al(mal)_3组(1.77±0.14)和100μmol/L Al(mal)_3+FINO_2组(2.33±0.14)水平升高(P<0.05);与100μmol/L Al(mal)_3+DMSO组的TFR1蛋白表达水平(1.66±0.40)相比,100μmol/L Al(mal)_3+FINO_2组的TFR1蛋白表达水平(2.33±0.14)表现为升高(P<0.05),而100μmol/L Al(mal)_3+DFO组的TFR1蛋白表达水平(1.58±0.26)则略微降低(P>0.05)。对原代神经元中DMT1蛋白表达水平分析结果如下:100μmol/L Al(mal)_3、100μmol/L Al(mal)_3+DMSO组以及100μmol/L Al(mal)_3+FINO_2组的DMT1表达水平分别为(0.81±0.14)、(0.93±0.47)、(1.29±0.49),与0μmol/L Al(mal)_3组(0.42±0.11)相比均升高,差异有统计学意义(P<0.05);与0.5%DMSO组(0.58±0.37)相比,100μmol/L Al(mal)_3+DMSO组和100μmol/L Al(mal)_3+FINO_2组DMT1蛋白表达分别为(0.93±0.47)、(0.58±0.26),均升高且差异有统计学意义(P<0.05),与50μmol/L DFO组之间DMT1蛋白表达(0.50±0.36)差异不明显(P>0.05);与100μmol/L Al(mal)_3+DMSO组(0.93±0.47)相比,100μmol/L Al(mal)_3+FINO_2组的DMT1表达(1.29±0.49)明显上升(P<0.05)。对原代神经元中铁代谢相关物质TFR1m RNA表达水平分析结果如下:与0μmol/L Al(mal)_3组(1.00±0.00)相比,20μmol/L FINO_2组(1.87±0.59)和100μmol/L Al(mal)_3+FINO_2组(2.11±0.21)的TFR1m RNA表达升高(P<0.05);与0.5%DMSO组(1.23±0.21)相比,20μmol/L FINO_2组TFR1m RNA表达(1.87±0.59)明显升高(P<0.05);与100μmol/L Al(mal)_3+DMSO组(1.55±0.60)相比,100μmol/L Al(mal)_3+FINO_2组的TFR1m RNA表达(2.11±0.21)明显升高(P<0.05),TFR1m RNA表达在50μmol/L DFO组(1.09±0.20)和100μmol/L Al(mal)_3+DFO组(0.82±0.18)均降低(P<0.05)。对原代神经元中DMT1m RNA表达水平分析结果如下:与0μmol/L Al(mal)_3组(1.00±0.00)相比,在100μmol/L Al(mal)_3+DMSO组(1.45±1.06)和100μmol/L Al(mal)_3+FINO_2组(2.52±2.29)显著升高(P<0.05),经DFO处理后,100μmol/L Al(mal)_3+DFO组的DMT1 m RNA表达(1.05±0.22)与0μmol/L Al(mal)_3组(1.00±0.00)无明显差异(P>0.05);与0.5%DMSO组(1.12±0.6)相比,100μmol/L Al(mal)_3+DMSO组(1.45±1Real-time biosensor.06)、20μmol/L FINO_2组(1.84±0.6)和100μmol/L Al(mal)_3+FINO_2组(2.52±0.29)均升高(P<0.05),100μmol/L Al(mal)_3+DFO组(1.05±0.22)的DMT1 m RNA表达与溶剂对照组无明显差异(P>0.05);与100μmol/L Al(mal)_3+DMSO组(1.45±1.06)相比,Al(mal)_3+FINO_2组的DMT1m RNA表达(2.52±2.29)升高(P<0.05)。对原代神经元中FPN1m RNA表达水平分析结果如下:与0μmol/L Al(mal)_3组(1.00±0.00)相比,FPN1m RNA表达在100μmol/L Al(mal)_3组(0.90±0.13)、20μmol/L FINO_2组(0.77±0.44)均降低但差异无统计学意义(P>0.05),与100μmol/L Al(mal)_3+FINO_2组的FPN1m RNA表达(0.45±0.23)相比则明显降低(P<0.05);与0.5%DMSO组(1.26±0.15)相比,100μmol/L Al(mal)_3+FINO_2组FPN1m RNA表达(0.45±0.23)明显降低(P<0.05),与50μmol/L DFO组之间FPN1m RNA表达(1.30±0.23)则无明显差异(P>0.05);与100μmol/L Al(mal)_3+DMSO组(1.07±0.53)相比,100μmol/L Al(mal)_3+FINO_2组FPN1m RNA表达(0.45±0.23)明显降低(P<0.05)。对原代神经元中FTH1m RNA表达水平分析结果如下:与0μmol/L Al(mal)_3组(1.00±0.00)、0.5%DMSO组(1.03±0.25)和100μmol/L Al(mal)_3+DMSO组(1.12±0.40)相比,FTH1m RNA表达在100μmol/L Al(mal)_3+DFO组(2.06±0.27)和100μmol/L Al(mal)_3+FINO_2组(4.51±0.94)均明显升高(P<0.05)。结论:Al(mal)_3染毒可导致原代神经元出现铁死亡、凋亡、坏死和自噬,但Ferroptosis是其重要的死亡方式。氧化损伤是铝致原代神经元Ferroptosis的机制之一,其可能作用途径为:铝通过抑制原代神经元SLC7A11表达使进入细胞内的半胱氨酸量减少,进而使GSH合成减少、GPX4失活,细胞内氧化还原状态失衡,最终导致原代神经元发生Ferroptosis。铁代谢失衡也是铝致原代神经元Ferroptosis的机制之一,其可能作用机制为:铝可通过增加原代神经元TFR1、DMT1、FTH1表达,降低FPN1表达引起细胞内铁代谢失衡,铁离子蓄积,从而诱发Ferroptosis。