毕赤酵母甲酸脱氢酶辅因子特异性改造及应用

甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase, FDH, EC 1.2.1.2)在发酵工业中常被应用于酶法辅因子再生系统。为了改造巴斯德毕赤酵母甲酸脱氢酶(FDH from Komagataella phaffii,KphFDH)的辅因子特异性并应用于体外NADPH辅因子再生系统，研究基于多序列比对和文献调研的结果，确定了D195、Y196为突变位点，构建了16个突变体，并RSL3体外表征了野生型和突变体的比酶活力和酶促反应动力学。得到最优的NADP~+特异性突变体为KphFDH~(D195Q/Y196R),其对NADP~+的催化效率(k_(cat)/K_m)为1.967 L/(mmol·s),催化特异性比率[(k_(cat)/K_m~(NADP+))/(k_(cat)/K_m~(NAD+))]为36.426;以NADP~RAD001抑制剂+作为辅因子时，对甲酸的催化效率(k_(cat)/K_m)为0.020 L/(mmol·s)。最后成功将该突变体应用于苯丙酮酸还原胺化反应中的NADPH再生，200 min内几乎完全反应。该研究填补了毕赤酵母FDH辅因子特异性chronic suppurative otitis media改造方面的研究空白，为发酵工业中NADPH辅因子再生系统应用提供了一种工具酶，同时也为进一步改造该酶的辅因子特异性提供了一种出发突变体。