单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,Lm)是一种食源性致病菌,广泛存在于自然界中,能够在低温条件下存活,极易污染低温冷藏食物。Lm能够穿越人和动物的肠道、胎盘及血脑三大屏障引发李斯特菌病,主要临床症状表现为流产、脑膜炎和败血症等,致死率达20～30%。Listeriolysin O(LLO)是Lm的主要毒力因子之一,由hly基因编码,在Lm侵入宿主细胞后裂解吞噬体膜、协助Lm逃逸。噬菌体作为特异性强、无残留的生物源杀菌剂,能够有效抑制Lm的污染,然而针对不同Lm抑制呈现差异性,其与Lm的相互作用仍不完全清楚。此外,Lm具有良好环境适应性,其形成的生物被膜与Lm污染控制息息相关。为此,本研究以来源于食品的Lm NJ05为研究载体,通过同源重组技术构建hly基因缺失株Lm NJ05-Δhly,鉴定其生长性能、运动能力、细胞粘附力及侵袭力等生物学特性,解析毒力因子LLO在生物被膜形成和噬菌体敏感性过程中的作用机理。主要结果如下:利用同源重组技术成功构建Lm NJ05-Δhly缺失株,分析其生长特性发现Lm NJ05-Δhly缺失株在稳定期的生长性能高于Lm NJ05野生株;运动性增强,溶血性消失。Lm NJ05-Δhly缺失株对RAW264.7细胞的黏附率和侵袭率分别降低84.93%和43.88%;与Lm NJ05野生株相比,Lm NJ05-Δhly对RAW264.7线粒体膜电位不产生影响,也不会造成线粒体活性氧(ROS)的积累,由此表明hly基因缺失后降低了 Lm对细胞线粒体的损伤。为了探究LLO毒力因子对Lm生物被膜的影响,通过结晶紫染色评价Lm生物被膜的形成能力。结果表明hly基因缺失后,生物被膜的形成能力显著下降,OD590nm由2.40降至0.70;分析生物被膜Tofacitinib生产商中Lm的菌含量发现,Lm NJ05-Δhly在生物被膜中的含量降低约1log10 CFU/mL。在添加0.5%葡萄糖时,Lm NJ05生物被膜形成能力最强,生物被膜的形成能力随着葡萄糖的浓度增加表现为先增后减的趋势;而Lm NJ05-Δhly生物被膜形成与葡萄糖浓度呈正相关,在8%葡萄糖时生物被膜形成量最大。通过分析缺失株Lm NJ05-Δhly对噬菌体vB-LmoM-NJ05的成斑效率、体外裂解活性、吸附性以及一步生长曲线探究hly基因缺失引发的Lm与噬菌体相互作用的影响。hlhepatic adenomay缺失株与噬菌体vB-LmoM-NJ05相互作用后的成斑效率降低约100倍;体外裂解分析表明,噬菌体vB-LmoM-NJ05对缺失株Lm NJ05-Δhly裂解效果降低;吸附特性表明,Lm NJ05-Δhly(15 min)吸附力较Lm NJ05延迟,且吸附力较弱;一步生长曲线试验表明Lm NJ05-Δhly并没明显的爆发期,平均爆发量约为0.122 PFU/Cell,远低于Lm NJ05(78.29 PFU/细菌)。将 108 PFU/mL 噬菌体作用于 Lm NJ05-Δhly 的生物被膜,能够完全抑制和清除其生物被膜。同时,噬菌体vB-LmoM-NJ05能够缓解Lm NJ05对RAW264.7巨噬细胞造成的损伤:抑制线粒体膜电位降低和ROS的积累,降低Lm对细胞的粘附和侵袭能力。将野生株Lm NJ05和缺失株Lm NJ05-Δhly进行转录组分析,比较hly基因缺失后Lm NJ05菌株基因的差异表达情况。结果显示:hly基因缺失后,差异表达基因有2218个,其中1896个基因表达下调,322个基因表达上调。对筛选出的2218个差异表达基因进行了 GO功能富集和KEGG通路富集分析,结果发现:GO功能富集主要表现在DNA修复、细胞对压力的反应、蛋白代谢过程以及水解酶合成;KEGG富集途径主要集中在肽聚糖生物合成、嘌呤代谢、O-抗原核苷酸mTOR抑制剂糖生物合成和D-氨基酸代谢等途径。分析具体差异基因的表达发现:hly基因缺失后,与Lm噬菌体敏感性、致病性、生物被膜和运动性相关基因出现显著下调。由此表明LLO能够显著调控Lm致病性、噬菌体敏感性和生物被膜的形成。综上所述:LLO作为Lm至关重要的毒力因子,能够调控Lm的致病性、生物被膜形成和噬菌体敏感性。本研究为Lm的致病性和噬菌体防控提供新靶点,为噬菌体在食品生物防控应用奠定理论依据。