研究目标:本课题组的研究目标:探索槐果碱在脂多糖诱导的脓毒性心肌病心肌细胞损伤中发挥着何种作用,并进一步揭示其中可能存在的潜在机制。实验方法:(1)在体实验:从湖南斯莱克景达公司购买32只7周龄的野生型雄性SPF级C57BL/6小鼠,平均每只小鼠重量大约在20克左右,于南昌大学江西医学院南院实验室动物饲养中心适应性喂养1周。然后按照随机分配的原则将32只小鼠分为4组,每组8只小鼠。组别名称分别为Control组、Sophocarpine组、LPS组及LPS+Sophocarpine组,每组小鼠予以不同的干预。Control组:首先以0.5ml的生理盐水腹腔注射入小鼠体内,每天1次,连续7天;在第8天时再次腹腔注射1次0.5ml的生理盐水入小鼠体内,然后持续观察小鼠的生存状态24小时。Sophocarpine组:首先以0.5ml的槐果碱溶液(Sophocarpine,20mg/kg)腹腔注射入小鼠体内,每天1次,连续7天;在第8天时再次腹腔注射1次0.5ml的生理盐水入小鼠体内,然后持续观察小鼠的生存状态24小时。LPS组:首先以0.5ml的生理盐水腹腔注射入小鼠体内,每天1次,连续7天;在第8天时再次腹腔注射1次0.5ml的脂多糖溶液(LPS,10mg/kg)入小鼠体内,然后持续观察小鼠的生存状态24小时。LPS+Sophocarpine组:首先以0.5ml的槐果碱溶液(Sophocarpine,20mg/kg)腹腔注射入小鼠体内,每天1次,连续7天;在第8天时再次腹腔注射1次0.5ml的脂多糖溶液(LPS,10mg/kg)入小鼠体内,然后持续观察小鼠的生存状态24小时。24小时后,对每只小鼠采取心脏超声操作,观察小鼠心功能状态。当完成小鼠心脏超声检测后,处死小鼠并收集其血液及心脏组织标本。取小鼠血清采用自动检测生化仪检测心肌损伤标志物包括CK,CK-MB和LDH等。将小鼠心脏切片用石蜡包埋,采用H&E染色法检测小鼠心脏组织损伤情况。取小鼠血清采用ELISA法检测小鼠血清中相关炎症因子(IL-1β,IL-6,TNF-α)的水平。取冻存于负80度冰箱中的小鼠心脏组织,采用蛋白印迹分析法检测小鼠心脏组织中相关炎症因子(IL-1β,IL-6,TNF-α,MCP-1,NLRP3)的表达水平,并进一步检测经典炎症信号通路蛋白(TLR-4,NF-κB)的表达水平。取小鼠心脏石蜡切片,采取TUNEL染色法检测小鼠心脏组织凋亡的水平。取冻存于负80度冰箱中的小鼠心脏组织,采用蛋白印迹分析法检测小鼠心脏组织中相关细胞凋亡蛋白(cleaved-caspase 3,Cyto-C,Bax,Bcl-2)的表达水平。取小鼠心脏石蜡切片,采取DHE染色法检测小鼠心脏组织氧化应激的水平。取小鼠血清采用相关试剂盒法检测小鼠血清中相关氧化应激标志物(MDA,SOD,GSH)的水平。取冻存于负80度冰箱中的小鼠心脏组织,采用蛋白印迹分析法检测小鼠心脏组织中相关氧化应激蛋白(SOD-1,SOD-2)的表达水平,并进一步检测氧化应激信号通路蛋白(Nrf2,HO-1)的表达水平。取冻存于负80度冰箱中的小鼠心脏组织,采用蛋白印迹分析法检测小鼠心脏组LBH589说明书织中相关细胞自噬蛋白(Beclin 1,P62,LC3Ⅱ)的表达水平。(2)体外实验:H9C2心肌细胞从中国医学科学院购买获得,将获得的H9C2心肌细胞进行传代。选取细胞生长状态良好的呈现出对数期生长的H9C2心肌细胞,采用胰酶消化的方式将H9C2心肌细胞从皿的壁上消化下来,按细胞数浓度4*10^4/ml种板于大皿中,然后将H9C2心肌细胞放置于37摄氏度,5%二氧化碳环境的孵育箱中孵育培养。然后按照随机分配的原则将H9C2心肌细胞分为5组,组别名称分别为Control组、LPS组、LPS+Sophocarpine(1μM)组、LPS+Sophocarpine(5μM)组和LPS+Sophocarpine(10μM)组,每组H9C2心肌细胞予以不同的干预。Control组:该组H9C2心肌细胞不予任何处理;LPS组:该组H9C2心肌细胞不予槐果碱(Sophocarpine)预处理,而是以脂多糖(LPS,10μg/ml)处理H9C2心肌细胞24小时;LPS+Sophocarpine(1μM)组:该组H9C2心肌细胞先给予槐果碱(Sophocarpine,1μM)预处理,然后再以脂多糖(LPS,10μg/ml)处理H9C2心肌细胞24小时;LPS+Sophocarpine(5μM):该组H9C2心肌细胞先给予槐果碱(Sophocarpine,5μM)预处理,然后再以脂多糖(LPS,10μg/ml)处理H9C2心肌细胞24小时;LPS+Sophocarpine(10μM)组:该组H9C2心肌细胞先给予槐果碱(Sophocarpine,10μM)预处理,然后再以脂多糖(LPS,10μg/ml)处理H9C2心肌细胞24小时。选取细胞生长状态良好的呈现出对数期生长的H9C2心肌细胞,对H9C2心肌细胞进行ROS免疫荧光染色可以用于评估H9C2心肌细胞在经过干预后其细胞的氧化应激水平。取干预后的H9C2心肌细胞,采用蛋白印迹分析法检测其中相关炎症因子(IL-1β,IL-6,TNF-α,MCP-1,NLRP3)的表达水平,并进一步检测经典炎症信号通路蛋白(TLR-4,NF-κB)的表达水平。取干预后的H9C2心肌细胞,采用蛋白印迹分析法检测其中相关细胞凋亡蛋白(cleaved-caspase 3,Cyto-C,Bax,Bcl-2)的表达水平。取干预后的H9C2心肌细胞,采用蛋白印迹分析法检测其中相关氧化应激蛋白(SOD-1,SOD-2)的表达水平,并进一步检测氧化应激信号通路蛋白(Nrf2,HO-1)的表达水平。取干预后的H9C2心肌细胞,采用蛋白印迹分析法检测其中相关细胞自噬蛋白(Beclin 1,P62,LC3Ⅱ)的表达水平。实验结果:(1)小鼠心脏超声检测结果显示以槐果碱预处理小鼠可以减轻脂多糖诱导的小鼠心功能障碍;同时检测了小鼠心脏的左室射血分数(EF%)和左室缩短率(FS%),结果显示以槐果碱预处理小鼠可以逆转脂多糖诱导的心脏左室射血分数(EF%)和左室短轴缩短率(FS%)的降低。(2)采用全自动生化仪去检测了心肌损伤标志物(CK、CK-MB及LDH)的血清水平,结果显示以槐果碱预处理小鼠可以逆转脂多糖诱导的这些心肌损伤标志物(CK、CK-MB及LDH)血清水平的升高。(3)采用H&E染色法检测小鼠心脏组织损伤的情况,结果显示以槐果碱预处理小鼠可以逆转脂多糖诱导的小鼠心肌细胞水肿及细胞核排列紊乱等。采用ELISA法检测小鼠血清中相关炎症因子(IL-1β、IL-6及TNF-α)表达水平的变化,结果显示以槐果碱预处理小鼠可以逆转脂多糖诱导的相关炎症因子(IL-1β、IL-6及TNF-α)血清水平的升高。(4)采用蛋白印迹分析(Western blot)法检测小鼠心脏组织中炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1及NLRP3)表达水平的变化,结果显示以槐果碱预处理小鼠可以逆转脂多糖诱导的小鼠心脏组织中炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1及NLRP3)表达水平的升高。进一步采用蛋白印迹分析(Western blot)法检测小鼠心脏组织中经典炎症信号通路蛋白(TLR-4和NF-κB)表达水平的变化,结果显示以槐果碱预处理小鼠可以逆转脂多糖诱导的小鼠心脏组织中经典炎症信号通路蛋白(TLR-4和NF-κB)表达水平的升高。(5)采用TUNEL染色法检测小鼠心脏组织中细胞凋亡水平的变化,结果显示以槐果碱预处理小鼠可以逆转脂多糖诱导的小鼠心肌细胞中细胞凋亡水平的升高。进一步采用蛋白印迹分析(Western blot)法检测小鼠心脏组织中细胞凋亡相关蛋白(cleaved-caspase 3、Cyto-C、Bax及Bcl-2)表达水平的变化,结果显示以槐果碱预处理小鼠可以逆转脂多糖诱导的小鼠心肌细胞中促细胞凋亡蛋白(cleaved-caspase 3、Cyto-C及Bax)表达水平的升高,同时可以逆转脂多糖诱导的小鼠心肌细胞中抗细胞凋亡蛋白(Bcl-2)表达水平的降低。(6)采用DHE染色法检测小鼠心脏组织中氧化应激水平的变化,结果显示以槐果碱预处理小鼠可以逆转脂多糖诱导的小鼠心肌细胞中氧化应激水平的升高。采用相关试剂盒法检测小鼠血清中氧化应激相关标志物(MDA、SOD及GSH)表达水平的变化,结果显示以槐果碱预处理小鼠可以逆转脂多糖诱导的小鼠血清中氧化应激相关标志物(MDA)表达水平的升高,同时可以逆转脂多糖诱导的小鼠血清中氧化应激相关标志物(SOD和GSH)表达水平的降低。(7)采用蛋白印迹分析(Western blot)法检测小鼠心脏组织中抗氧化应激蛋白(SOD-1和SOD-2)表达水平的变化,结果显示以槐果碱预处理小鼠可以逆转脂多糖诱导的小鼠心脏组织中抗氧化应激蛋白(SOD-nonsense-mediated mRNA decay1和SOD-2)表达水平的降低。进一步采用蛋白印迹分析(Western blot)法检测小鼠心脏组织中氧化应激信号通路蛋白(Nrf2和HO-1)表达水平的变化,结果显示以槐果碱预处理小鼠可以使小鼠心脏组织中氧化应激信号通路蛋白(Nrf2和HO-1)的表达水平升高。(8)采用蛋白印迹分析(Western blot)法检测小鼠心脏组织中细胞自噬相关蛋白(Beclin 1、P62及LC3Ⅱ)表达水平的变化,结果显示以槐果碱预处理小鼠可以逆转脂多糖诱导的小鼠心肌细胞中促细胞自噬蛋白(Beclin 1和LC3Ⅱ)表达水平的升高,同时可以逆转脂多糖诱导的小鼠心肌细胞中抗细胞自噬蛋白(P62)表达水平的降低。(9)采用蛋白印迹分析(Western blot)法检测H9C2心肌细胞中相关炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1及NLRP3)表达水平的变化,结果显示以槐果碱预处理H9C2心肌细胞可以逆转脂多糖诱导的H9C2心肌细胞中炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1及NLRP3)表达水平的升高。进一步采用蛋白印迹分析(Western blot)法检测H9C2心肌细胞中经典炎症信号通路蛋白(TLR-4和NF-κB)表达水平的变化,结果显示以槐果碱预处理H9C2心肌细胞可以逆转脂多糖诱导的H9C2心肌细胞中经典炎症信号通路蛋白(TLR-4和NF-κB)表达水平的升高。(10)采用蛋白印迹分析(Western blot)法检测H9C2心肌细胞中细胞凋亡相关蛋白(cleaved-caspase 3、Cyto-C、Bax及Bcl-2)表达水平的变化,结果显示以槐果碱预处理H9C2心肌细胞可以逆转脂多糖诱导的H9C2心肌细胞中促细胞凋亡蛋白(cleaved-caspase 3、Cyto-CFerrostatin-1半抑制浓度及Bax)表达水平的升高,同时可以逆转脂多糖诱导的H9C2心肌细胞中抗细胞凋亡蛋白(Bcl-2)表达水平的降低。(11)采用ROS免疫荧光染色法检测H9C2心肌细胞中氧化应激水平的变化,结果显示以槐果碱预处理H9C2心肌细胞可以逆转脂多糖诱导的H9C2心肌细胞中氧化应激水平的升高。采用蛋白印迹分析(Western blot)法检测H9C2心肌细胞中抗氧化应激蛋白(SOD-1)表达水平的变化,结果显示以槐果碱预处理H9C2心肌细胞可以逆转脂多糖诱导的H9C2心肌细胞中抗氧化应激蛋白(SOD-1)表达水平的降低。进一步采用蛋白印迹分析(Western blot)法检测H9C2心肌细胞中氧化应激信号通路蛋白(Nrf2和HO-1)表达水平的变化,结果显示以槐果碱预处理H9C2心肌细胞可以使H9C2心肌细胞中氧化应激信号通路蛋白(Nrf2和HO-1)的表达水平升高。(12)采用蛋白印迹分析(Western blot)法检测H9C2心肌细胞中细胞自噬相关蛋白(Beclin 1、P62及LC3Ⅱ)表达水平的变化,结果显示以槐果碱预处理H9C2心肌细胞可以逆转脂多糖诱导的H9C2心肌细胞中促细胞自噬蛋白(Beclin 1和LC3Ⅱ)表达水平的升高,同时可以逆转脂多糖诱导的H9C2心肌细胞中抗细胞自噬蛋白(P62)表达水平的降低。结论:(1)槐果碱能减轻脂多糖诱导的脓毒性心肌病心肌细胞的损伤。(2)槐果碱能减轻脂多糖诱导的脓毒性心肌病心肌细胞中的炎症水平,其可能是通过抑制TLR-4/NF-κB炎症信号通路的激活从而发挥其抗炎作用。(3)槐果碱能减轻脂多糖诱导的脓毒性心肌病心肌细胞中的细胞凋亡水平。(4)槐果碱能减轻脂多糖诱导的脓毒性心肌病心肌细胞中的氧化应激水平,其可能是通过激活Nrf2/HO-1氧化应激信号通路从而发挥其抗氧化应激作用。(5)槐果碱能减轻脂多糖诱导的脓毒性心肌病心肌细胞中的细胞自噬水平。