桑树是桑科植物中最有价值的植物之一,是一种适应性强、分布广、生长迅速的落叶植物。我国种植桑树历史悠久,也是世界上最大的种植国,因此桑叶资源丰富。由于桑叶中蛋白含量高,不仅作为家蚕的饲料,并且桑叶中丰富的多酚类化合物(主要是黄酮类化合物)具有良好的抗炎和抗氧化能力,用于养殖对动物的健康生产十分有益,因此也可作为家畜饲料的重要资源。而桑叶作为中药材使用在我国同样具有悠久历史,因其具有多种生物活性物质,被广泛用于治疗各种疾病。溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)是一种慢性非特异性炎症性肠病,其典型的临床症状包括腹痛、腹泻和血便,严重影响患者的日常生活。目前治疗UC的药物主要包括5-氨基水杨酸药物、皮质类固醇和免疫抑制剂。这些药物具有一定的治疗效果,但长期使用会削弱患者免疫力,且价格昂贵。因此,从天然植物源生物活性物质中筛选低成本、低毒和有效的候选药物非常重要。黄酮类化合物具有较好的抗炎活性,其在桑叶中的含量十分丰富。本研究利用不同浓度的乙醇(30%、50%和75%)对提取的桑叶总黄酮(Mulberry leaf flavonoids,MLFs)进行洗脱,并对他们的成分进行分析。从中筛选出抗炎效果最佳的乙醇浓度洗脱MLF,并利用小鼠进行MLF毒理试验以确定其安全浓度范围,进一步评估其在葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导的小鼠UC中的抗炎效果,为开发利用MLF提供理论依据。本研究取得结果如下:1.MLFs的抗炎和抗氧化活性研究利用30%、50%和75%浓度的乙醇对MLFs进行梯度洗脱,分别得到30%MLF、50%MLF和75%MLF,其中30%MLF总黄酮含量最高。利用代谢组学的方法发现三种MLFs之间具有24种差异黄酮类化合物,其中30%MLF中的槲皮素、山奈酚及它们的衍生物含量明显高于50%MLF和75%MLF。在脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导小鼠RAW 264.7细胞建立的炎症模型中比较不同乙醇浓度洗脱MLF的抗GSI-IX molecular weight炎活性。结果显示,30%MLF、50%MLF和75%MLF均显著抑制LPS诱导RAW 264.7细胞产生的一氧化氮(nitric oxide,NO)、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)、环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)和细胞因子的产生。同时,30%MLF、50%MLF和75%MLF均可通过减少活性氧(oxygen species,ROS)的生成、清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基、提高金属离子螯合活性和还原能力,从而增强抗氧化能力,其中30%MLF具有最佳抗炎效果。2.30%MLF的毒性研究利用急性毒性试验和亚急性毒性试验对30%MLF的安全浓度范围进行了研究。急性毒性结果显示30%MLF的最大给药量为20 g/kg·bw,表明其LD_(50)>5 g/kg·bw,属于实际无毒物质。28天亚急性毒性试验结果发现,低浓度(2.5 g/kg)、中浓度(5g/kg)和高浓度(10 g/kg)的30%MLF均不会引起小鼠死亡,三个浓度组的血常规、血生化检测指标与对照组均无显著性差异。并且对肝脏、肾脏和脾脏的组织学检查也无中毒现象。以上结果表明30%MLF具有较大的安全剂量范围。3.30%MLF对DSS诱导的小鼠UC的缓解作用与机制采用DSS诱导的小鼠UC模型探索了30%MLF的抗炎效果,结果显示:30%MLF能缓解UC小鼠体重减轻、采食量下降、疾病活动指数(Disease Activity Index,DAI)升高、结肠缩短及脾脏肿大等临床症状。其次,30%MLF能缓解UC小鼠中腺体排列不规则、炎性细胞浸润和隐窝大量缺失等结肠炎典型的病理特征,同时降低其组织学评分。30%MLF可以显著缓解UC小鼠杯状细胞数目减少、黏蛋白MUC2和紧密连接蛋白(claudin-1和ZO-1)大量丢失的现象,说明30%MLF对UC小鼠的肠道屏障具有保护作用。30%MLF还可降低UC小鼠中炎症因子的产生从而缓解炎症反应。结肠组织免疫组化(immunohistochemistry,IHC)结果发现30%MLF抑制TLR4和My D88的蛋白表达,免疫印迹(Western blot,WB)结果表明30%MLF显著抑制DSS激活的MAPK通路中关键蛋白(ERK1/2、p38和JNK)和NF-κB通路中关键蛋白(p65和IκBα)磷酸化水平的增加。在LPS诱导的RAW 264.7细胞中的结果与体内结果一致,30%MLF同样能够显著抑制TLR4/My D88通路的Z-VAD-FMK激活、以及MAPK和NF-κB中关键蛋白的磷酸化水平。利用NF-κB的抑制剂Bay11-7085处理LPS诱导的RAW 264.7细胞,发现Bay11-7085可以显著抑制NO、PGE2及炎症因子的产生。结果表明,30%MLF可缓解DSS诱导小鼠产生的UC,其机制涉及TLR4/My D88/MAPK/NF-κB通路。4.30%MLF对DSS诱导的结肠炎小鼠肠道菌群及代谢物途径的影响16S rDNA高通量测序结果显示:经过30%MLF的处理,UC小鼠的菌群结构与Control组菌群结构趋于一致,特别是增加了一些益生菌的相对丰度,如Blautia、Lachnoclostridium、Lachnospiraceae＿NK4A136＿group和Ligilactobacillus。同时提高了UC小鼠肠道内容物中乙酸和丁酸的含量。用代谢组学技术对30%MLF处理UC小鼠肠道内容物进行了检测和分析,结果发现30%MLF可缓解UC中部分氨基酸及其代谢物和甘油磷脂类代谢物的代谢紊乱,涉及的代谢通路主要为磷脂代谢、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢。综上所述,30medium- to long-term follow-up%MLF是抗炎效果较好的MLFs,30%MLF可能会通过降低炎症因子表达、保护肠道屏障功能、改善肠道菌群结构、调节氨基酸代谢和磷脂代谢来改善DSS诱导产生的小鼠UC,并且TLR4/My D88/MAPK/NF-κB通路可能参与了30%MLF的抗炎机制。因此,本研究对30%MLF的抗炎活性和机制研究具有重要科学意义,为MLF的深入开发利用提供了理论依据,为桑叶作为功能性食品、畜牧无抗饲料等的多元开发利用提供指导。