1、全基因组分析鉴定柔毛淫羊藿UGT家族。柔毛淫羊藿(Epimedium pubescens Maxim.)是《中华人民共和国药典》(2020年版)淫羊藿的主要基原物种,也是首个实现基因组测序的淫羊藿属物种。本论文首先以其他植物的UDP-糖基转移酶(ULaduviglusib采购GT)作为同源序列(Query)在柔毛淫羊藿基因组中进行搜索,并且在Pfams数据库和NCBI CDD数据库中确认是否有完整的结构域和保守域(PSPG),最终筛选出339条柔毛淫羊藿UDP-糖基转移酶(EpUGT)家族基因,是迄今为止植物中已鉴定出较大的UGT家族之一。对EpUGT基因进行序列特征、染色体分布、基因共线性等生物信息学分析发现,EpUGT基因不均匀地分布在柔毛淫羊藿的六条染色体上,存在多个大片段复制事件和大量串联复制,这些基因重复是EpUGT基因家族扩张的主要原因。对于EpUAZD9291临床试验GT的亚细胞定位预测显示,大部分EpUGT(77.29%)定位于细胞质,少数EpUGT定位于其它细胞器。组织表达谱的分析结果表明,UGT基因在根、叶和花中的表达普遍较高。高光强诱导可以提高淫羊藿苷等成分含量,据此筛选出一些高光强响应的UGT基因。2、柔毛淫羊藿A组UGT79家族基因筛选与克隆。柔毛淫羊藿UGT家族的系统发育分析共聚类为16个组(Group),包括较为保守的(A-N)组以及较晚发现的O和Q组,对这些UGT进行了序列结构分析和保守基序(motif)比较,结果表明同一组中的UGT成员具有保守的基序组成和相似的基因结构,暗示不同UGT家族成员之间可能存在功能差异。植物中糖基化类黄酮3-OH的UGT通常处在F组,而糖基化类黄酮7-OH、4′-OH的UGT通常来自B、C或D组,生成二糖苷或多糖苷的糖基化 UGT 通常在 A 组(又称 GGT,Glycoside glycosyltransferases)。A 组是柔毛淫羊藿UGT基因家族中成员最多的组,共有105个基因,约占总UGT基因的30.97%,由于淫羊藿中负责合成异戊烯基黄酮醇多糖苷的糖苷糖基转移酶GGT尚未鉴定,且在淫羊藿属其他物种中已鉴定6个淫羊藿中识别异戊烯基黄酮醇的糖基转移酶中,两个能够在3-OH添加鼠李糖的UGT以及一个能够在7-OH添加葡萄糖的UGT也聚类在A组,因此本研究选择A组基因进行研究。A组又包括UGT79家族、UGT91家族和UGT94家族,其中UGT79家族基因通常识别类黄酮为底物,本研究从UGT79家族的59条序列(命名为EpGT1～EpGT59)中筛选得到22个在根或叶中相对于果实有更高表达的基因,加上在基因组中未能染色体定位的基因片段EpGT60。随后以柔毛淫羊藿叶片总cDNA为模板,采用巢式PCR技术对这23个基因进行克隆,最终得到了 9个候选基因序列。3、柔毛淫羊藿A组UGT79家族基因的功能验证。对9个候选糖基转移酶基因进行大肠杆菌异源表达和重组蛋白诱导与纯化,对重组蛋白进行酶活检测,鉴定了 3个糖基转移酶,分别为识别异戊烯基黄酮醇的3-O-鼠李糖基转移酶EpGT60,识别异戊烯基黄酮醇3-O-鼠李糖苷的木糖糖基转移酶EpGT2(EpF3R2″XylT),以及识别花青素的糖苷糖基转移酶EpGT43。EpGT60能够以UDP-鼠李糖为供体催化8-异戊烯基山奈酚(8-prenylkaempferol)和淫羊藿素(8-异戊烯基山奈素,icaritin)的3-OH,分别得到宝藿苷Ⅱ(baohuoside Ⅱ)和宝藿苷Ⅰ(baohuoside Ⅰ)。EpGT60蛋白的功能与淫羊藿属中已鉴定的同样属于A组的两个UGT类似,分别是拟巫山淫羊藿(E.pseudowushanense)中鉴定的EpPF3RT和朝鲜淫羊藿(E.koreanum)中的EkF3URhaT。但底物选择性上有所区别,EpGT60蛋白具有严格的底物选择性,只对C-8位点上具有异戊烯基修饰的黄酮醇有催化活性。随后对重组EpGT60蛋白体外酶促反应的最适pH、温度和时间进行了探索,通过酶活动力学分析拟合了EpGT60催化8-异戊烯基山奈酚的Km值。通过亚细胞定位确认了 EpGT60蛋白在植物的细胞质内发挥糖基化作用,并利用重组EpGT60蛋白的微生物转化实验合成一定量的宝藿苷Ⅱ。EpGT2(EpF3R2″XylT)能够以UDP-木糖为供体,分别修饰淫羊藿苷(icariin)、宝藿苷 Ⅰ(baohuoside Ⅰ)、淫羊藿苷 A(epimedoside A)和宝藿苷 Ⅱ(baohuoside Ⅱ),分别得到产物朝藿定 B(epimedin B)、箭藿苷 B(sagittatoside B)、淫羊藿苷 E(epimedoside E)和淫羊藿苷 F(ikarisoside F)。EpF3R2″XylT 在异戊烯基黄酮醇3-O-鼠李糖苷底物的2″-OH上添加木糖糖基,对底物具有C-8位具有异戊烯基修饰山奈酚(或山奈素)和3-OH位点鼠李糖有着严格要求。EpF3R2″XylT是柔毛淫羊藿中合成主要活性成分朝藿定B的关键糖基转移酶。对重组EpF3R2″XylT蛋白体外酶促反应的最适pH、温度和时间进行了探索,通过酶活动力学分析拟合了 EpF3R2″XylT催化淫羊藿苷(icariin)、宝藿苷Ⅰ(baohuosideⅠ)和宝藿苷Ⅱ(baohuoside Ⅱ)的Km值,确认淫羊藿苷为EpF3R2″XylT的最适底物。通过亚细胞定位确认了 EpF3R2″XylT蛋白在植物的细胞质内发挥糖Device-associated infections基化作用,并通过烟草瞬时表达技术确定EpF3R2″XylT能够在植物体内催化淫羊藿苷发生木糖糖基化,从而合成朝藿定B。EpGT43能够以UDP-葡萄糖为供体,催化矢车菊素-3-O-鼠李糖苷添加一个葡萄糖,通过进化树和序列比对推断,其产物可能为矢车菊素3-O-[2-O-(-葡萄糖基)]-鼠李糖苷,具体产物结构有待进一步实验确定。本研究通过对柔毛淫羊藿UGT基因家族进行解析,对淫羊藿UGT79家族基因功能进行了探索,鉴定了 3个来自UGT79家族的EpUGT的功能,阐明了柔毛淫羊藿中异戊烯基黄酮醇糖苷中宝藿苷Ⅰ(baohuosideⅠ)、宝藿苷Ⅱ(baohuosideⅡ)、朝藿定 B(epimedinB)、箭藿苷 B(sagittatosideB)、淫羊藿苷 E(epimedosideE)和淫羊藿苷F(ikarisoside F),以及花青素苷中3-O-[2-O-(-葡萄糖基)]-鼠李糖苷的生物合成途径。表明柔毛淫羊藿A组UGT79家族成员功能的多样化,该家族成员既包括GGT,也包括有修饰3-OH位点的UGT。