黄龙病严重影响柑橘产业,柑橘木虱Diaphorina citri是黄龙病最主要的传播媒介。目前对柑橘木虱的防治主要采取化学防治法,但长期、大量化学农药的施用,引起害虫抗性、再残留和严重环境问题。蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20 E)作为昆虫发育和繁殖的关键激素,可以调节雌性卵巢发育,参与多种生理过程,是昆虫完成正常生命活动的重要激素之一,Halloween基因家族负责合成蜕皮激素,并且蜕皮激素与蜕皮激素受体、超气门蛋白结合才能发挥功能。此外,Halloween家族、蜕皮激素受体和超气门蛋白基因可能在昆虫的耐药性调节过程中起到关键作用。本研究通过PCR和RACE技术成功克隆了蜕皮激素合成通路4个Halloween基因完整c DNA、蜕皮激素受体和和超气门蛋白基因的完整CDS序列;利用RNA干扰技术探明了4个Halloween基因、蜕皮激素受体和超气门蛋白基因的主要功能;明确了Halloween及受体基因在不同农药下的响应情况,并通过敲低过表达的基因探明了柑橘木虱对农药的敏感性。研究结果探明了RNAi生物农药研制的潜在分子靶标,为ds RNA杀虫剂的开发及其参与昆虫杀虫剂耐受性的调节提供了理论基础。主要结果如下:(1)首次克隆得到柑橘木虱4个Halloween基因c DNA序列,并验证了Ec R和USP的完整CDS序列。Dc CYP307A1基因的完整c DNA 1748 bp,开放阅读框(ORF)长1491 bp,编码466个氨基酸残基(amino acid,aa);Dc CYP302A1完整c DNA 2020 bp,ORF:1458 bp,编码485 aa;Dc CYP315A1完整c DNA为2220bp,ORF:1497 bp,编码498 aa;Dc CYP314A1完整c DNA 1863 bp,ORF:1445bp,编码529 aa。4个Halloween基因具有血红素结合域、P/G rich domains、Helix-C、Helix-I、Helix-K以及PERF这些P450典型结构域。验证蜕皮激素受体Dc Ec R基因长度为1214 bp,ORF:930 bp,编码309 aa;Dc USP基因长度为1355 bp,ORF:1185 bp,编码394 aa。Dc Ec R和Dc USP均具有典型的DNA结合域(DBD)和配体结合域(LBD)。(2)明确柑橘木虱蜕皮激素合成通路4个关键基因及受体的m RNA时空表达谱和组织特异性表达谱。结果显示,Dc CYP307A1和Dc CYP315A1随着龄期的增长表达水平逐渐升高并在成虫期到达峰值,成虫期Dc CYP307A1的转录水平是5龄若虫(若虫期表达最高)的2.08倍;Dc CYP315A1在成虫期的表达水平是5龄若虫的1.93倍。Dc CYP302A1的转录峰值分别出现在卵期和成虫期,但卵期会更高,1龄和4龄若虫是其转录水平最低的时期,其中卵期表达量分别是1龄若虫4龄若虫的的1.38倍和1.55倍;Dc CYP314A1的转录峰值出现在卵期,在1至4龄若虫期表达水平情况明显下降(4龄若虫表达最低),5龄若虫和成虫期出现小幅上升,卵期的转录水平是4龄若虫的42.28倍;Dc Ec R的转录模式整体呈上升趋势,在成虫期达到转录峰值,其表达水平是1龄若虫期的23.38倍;Dc USP在5龄若虫期达到转录峰值,成虫期则出现了明显的转录下调,5龄若虫中的表达是卵期的3.01倍。此外,雌性成年柑橘木虱Halloween及受体基因的表达水平普遍高于雄性,但是72 h以后雄性Dc CYP307A1的表达量开始显著高于雌性。组织特异性表达显示,柑橘木虱Halloween及受体基因在柑橘木虱主要组织中均有表达。在主要的组织中,Dc CYP307A1在雄性精巢中具有高转录水平;Dc CYP302A1基因probiotic supplementation在雌性卵巢中具有显著的高转录水平;Dc CYP315A1在卵巢中的转录水平是所有组织中最高的,其显著高于雄性的精巢;柑橘木虱的CYP314A1基因在肠道的表达量是最高的,在雄性精巢的表达量显著低于雌性卵巢;受体Dc Ec R基因在头部的转录水平最高,在翅的表达水平最低;Dc USP在各组织的特异性表达与Dc Ec R的表达模式相似,其在头部的表达水平最高,其次是卵巢。(3)利用RNA干扰技术探明Halloween基因及受体基因在柑橘木虱发育、繁殖方面的作用。4个Halloween基因中的任何一个表达被抑制均会造成若虫体内蜕皮激素含量的显著降低;更严重的是,注射ds RNA导致Halloween及受体基因的表达被抑制,严重影响了柑橘木虱的发育,若虫日存活率(Dc CYP307A1、Dc CYP302A1、Dc CYP315A1、Dc CYP314A1、Dc Ec R和Dc USP分别为对照的27.43%、47.98%、49.02%、50.94%、43.28%和41.19%)、日羽化率(Dc CYP307A1、Dc CYP302A1、Dc CYP315A1、Dc CYP314A1、Dc Ec R和Dc USP分别为对照的50.37%、33.74%、46.36%、53.28%、36.44%和47.17%)等相关参数明显降低;Halloween及受体基因的表达被抑制后,成虫卵巢发育缓慢,卵黄原蛋白的表达下调,产卵量降低,但对雄虫影响不大;注HDAC抑制剂射ds Dc CYP302A1和ds Dc CYP314A1还会导致若虫发育变缓,体长显著变小;注射ds Ec R后,导致羽化的柑橘木虱成虫翅畸形;Dc USP的表达被抑制后,造成若虫干瘪死亡。(4)暴露于不同药剂(噻虫嗪、氯氰菊酯、吡丙醚)后Halloween基因及核受体基因的表达情况以及双链RNA(ds RNA)与3类药剂联用对柑橘木虱存活率的影响。结果显示,当柑橘木虱若虫暴露在3种浓度(LC_(10)、LC_(30)和LC_(50))的噻虫嗪中,仅Dc CYP315A1和Dc CYP314A1过表达;3种浓度的氯氰菊酯均会刺激Halloween基因及核受体过表达;吡丙醚则显著抑制了Halloween基因及核受体的表达,仅USP基因在LC_(10)剂量下过表达;成虫暴露于LC_(30)剂量的噻虫嗪,同样仅DCobimetinib配制c CYP315A1和Dc CYP314A1过表达;LC_(10)剂量的氯氰菊酯可以刺激Dc CYP315A1和Dc USP过表达,LC_(30)和LC_(50)条件下,Dc CYP314A1会过表达。干扰Dc CYP315A1、Dc CYP314A1、Dc Ec R和Dc USP的表达可以使柑橘木虱对杀虫剂的敏感性增强,导致死亡率显著上升。综上所述,本研究获得了4个Halloween基因的完整c DNA序列和这4个基因、蜕皮激素受体和超气门蛋白基因的时空表达谱和组织表达谱;明确了Halloween基因及受体在柑橘木虱发育繁殖中的功能,任何一个基因的表达被抑制均会影响柑橘木虱的发育,并阻碍成虫卵巢的正常功能;此外,Dc CYP315A1、Dc CYP314A1、Dc Ec R和Dc USP在不同农药中会出现不同程度的上调,敲低4个基因的表达会提高柑橘木虱对农药的敏感性,暗示可能参与昆虫的解毒代谢过程,为柑橘木虱的防治提供了一定的理论基础。