类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种严重的自身免疫性疾病,患者主要表现为肢体肿胀,关节有一定程度破坏,甚至丧失关节功能,导致患者无法正常生活。RA的成因复杂多样,其体内CD4~+T细胞过度活化导致的免疫失衡是RA形成和发展的重要原因之一。研究表明,旋毛虫(Trichinella spiralis,T.spiralis)及其分泌物在调节宿主机体免疫中发挥了重要作用,甚至对某些自身免疫性疾病具有良好的治疗作用。旋毛虫在入侵宿主后,其排泄分泌(ES)抗原可促进吲哚胺2,3双加氧酶(Indoleamine 2,3 dioxygenase,IDO)的表达来对宿主的免疫系统发挥调节作用,引起宿主机体的免疫抑制。本研究选择旋毛虫ES抗原主要成分中的P43蛋白(Tsp43),利用其免疫调节能力治疗RA,并进一步验证其机制,旨在为RA的治疗手段提供一种新思路,同时也为寄生虫生物制剂的相关研发奠定一定基础。本实验首先通过蛋白质印记(Western blotting,WB)和免疫荧光(Immunofluorescence,IF)验证了Tsp43能在体外促进树突状细胞(Dendritic cell,DC)表达IDO。随后转入体内实验,200只BALB/c小鼠被随机分为4组,分别为空白组、模型组(BCII)、蛋白组(BCII+Tsp43)和抑制组(BCII+Tsp43+1-MT),通过检测RA的各项特征性指标,验证Tsp43能否对牛II型胶原(Bovine Collagen type II,BCII)诱导的RA小鼠产生治疗作用,以及这种治疗作用是否具有IDO依赖性。本实验采用酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测各组小鼠血清中IL-1β、TNF-α含量;苏木素-伊红(Hematoxselleck AM-2282ylin-eosin,H(5)E)染色法检测各组小鼠后肢踝关节病理变化;流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测各组小鼠脾脏CD4~+/CD8~+T细胞比值。结果显示,RA小鼠血清中IL-1β、TNF-α含量远高于空白组,且其后肢踝关节受损严重,骨质受到严重破坏,软骨破坏相当严重,CD4~+/CD8~+T细胞比值也远高于空白组。经过Tsp43治疗后,RA小鼠体内IL-1β、TNF-α含量明显下降,受损踝关节有所恢复,脾脏内CD4~+/CD8~+T细胞比值也明显降低,而1-MT(IDO抑制剂)能很好地抑制Tsp43对RA小鼠的治疗作用,本实验结果表明,Tsp43对RA小鼠具有一定的治疗作用,而且这种治疗作用具有IDO依赖性。为进一步探究Tsp43对RA小鼠的IDO依赖性治疗机制,本实验采用Western blotting检测各组小鼠IDO表达情况,并通过ELISA检测后续IDO导致的血清中色氨酸(Tryptophan,Try)和犬尿氨酸(KynuGenetic diagnosisrenine,Kyn)的浓度变化。为了探究Tsp43通过IDO对CD4~+T细胞增殖能力的影响,本实验将各组小鼠脾脏CD4~+T细胞进行磁珠分选,验证其纯度后进行原代培养,检测各组小鼠脾脏CD4~+T细胞氨基酸感知相关蛋白GCN2和p-e IF2α的表达情况,并采用CCK-8法检测各组CD4~+T细胞在0、6、12、24、48、72 h的增殖能力变化;为了探究Tsp43通过IDO对CD4~+T细胞凋亡情况的影响,本实验检测了各组小鼠CD4~+T细胞凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、cl-CASP9、cl-CASP3、cl-PARP)的表达情况并采用FCM检测脾脏CD4~+T细胞的凋亡情况。除此之外,本实验还采用FCM检测了各组小鼠脾脏CD4~+CD25~+Treg细胞Foxp3的比例变化。结果显示,Tsp43通过RA小鼠体内IDO高表达减少色氨酸的浓度,从而促进CD4~+T细胞氨基酸感知相关蛋白GCN2、p-e IF2α的高表达,进而对CD4~+T细胞的增殖能力产生抑制作用。不仅如此,Tsp43促进IDO的表达后,使RA小鼠血清中GSKJ4研究购买犬尿氨酸浓度升高,导致RA小鼠体内使CD4~+T细胞促凋亡蛋白(Bax、cl-CASP9、cl-CASP3、cl-PARP)表达增多,抗凋亡蛋白(Bcl-2)表达减少,使CD4~+T细胞发生凋亡。除此之外,Tsp43使IDO高表达后,明显上调了RA小鼠体内CD4~+CD25~+Treg Foxp3的比例,从而对RA小鼠的免疫功能起到了一定负调节作用。综上所述,Tsp43对RA小鼠具有良好的治疗作用,其可以降低RA小鼠体内IL-1β、TNF-α含量,修复受损踝关节,并恢复CD4~+/CD8~+T细胞比值,且这种治疗作用具有IDO依赖性。其具体机制是Tsp43使RA小鼠体内IDO高表达,降低了色氨酸浓度,从而使氨基酸感知相关蛋白GCN2和p-e IF2α高表达,最终导致CD4~+T细胞的增殖能力受到抑制。同时IDO分解色氨酸产生了高浓度的犬尿氨酸,导致RA小鼠体内CD4~+T细胞发生凋亡。不仅如此,Tsp43可通过IDO提高CD4~+CD25~+Treg Foxp3的比例,从而对RA小鼠发挥免疫负调节作用。本研究证明了Tsp43通过IDO以多种方式共同调节RA小鼠体内CD4~+T细胞过度活化导致的免疫功能失衡,这为RA的治疗提供了一种新思路,同时也为研发治疗RA的寄生虫衍生药物奠定一定基础。