【目的】明确gdnfa基因在斑马鱼中的表达特征及其进化保守性，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立gdnfa~(+/-)F_1代杂合突变体，为KPT-330后续生成gdnfa~(-/-)F_2代纯合突变体打下基础，同时为探讨gdnfa基因在斑马鱼性腺分化和发育中的作用机制提供理论依据。【方法】通过下载不同物种的GDNF蛋白氨基酸序列，并分析其保守结构域，探究该基因在不同物种中的进化保守性。利用实时荧光定量PCR检测gdnfa基因在6月龄斑马鱼不同组织中的表达情况，并通过CRISPR/Cas9基因编辑技术获得gdnfa F_0代突变个体，随后与野生型回交获取gdnfa~(+/-)F_1代突变个体，并分析其基因型及突变类型。最后，通过组织石蜡切片分析3月龄gdnfa~(+/-)F_1代个体与同期野生型性腺组织间的差异。【结果】斑马鱼GDNFA蛋白分子量为26.89 kD，由235个氨基酸残基组成，包含13个疏水氨基酸和51个酸性氨基酸，理论等电点（pI）为8.455，且该蛋白存在1个TGF-β结构域。斑马鱼GDNFA蛋白序列进化较保守，与非洲爪蟾、小鼠和人类GDNFA蛋白具有相同的TGF-β结构域，推测GDNFA蛋白序列在鱼类、人类和爬型动物类中进化保守。gdnfa基因在6月龄斑马鱼的性腺（精巢和卵巢）、肾脏、肝脏、鳃和肌肉组织中均有表达，但精巢中gdnfa基因的相对表达量显著高于其他组织（P<0.01）。繁育得到的48尾斑马鱼gdnfa~(+/-)F_1代杂合突变体中产生了3种突变类型，分别为在靶点附近插入2个碱基（△+2 bp）、缺失2个碱基（△-2 bp）和缺失12个碱基（△-12 bp）。48尾gdnfa~(+/-)F_1代个体的雄性∶雌性=14∶34，呈现出明显的雌性性别偏向。与野生型斑马鱼GDNFA蛋白相比，斑马鱼gdnfa~(+/-)F_1代个体的GDNFA蛋白三级结构发生了明显变化。性腺石蜡切片观察发现，部分gdnfa~(+/-)F_1代个体（△-2 bp）精巢中A型精原细胞团减少，B型精原细胞团排列更疏松；部分个体（△-12 bp）卵巢中更多的皮质泡卵母细胞累积。【www.selleck.cn/products/BAY-73-4506结论】斑马鱼gdnfa基因与其他硬骨鱼类平行进化，且gdnfa基因在硬骨鱼类的进化过程中具有高度保守性；由于gdnfa基因在斑马鱼精巢发育中发挥作用，故gdnfa~(+/-)F_1代个体性别比例偏向于雌性，推测其参与斑马鱼性别分化。gdnfa~(+/-)F_1代杂合体部分功能的缺失对精原细胞的产生、皮层滤泡期卵母细胞到初级生长期Median paralyzing dose卵母细胞的过渡阶段起到阻滞作用。获得的gdnfa~(+/-)F_1代个体可用于生成gdnfa~(-/-)F_2代纯合个体。